本发明专利技术公开一种稳定表达mCherry‑tau的细胞系及其构建方法与应用，所述方法包括步骤：预先制备重组质粒pLVX‑mCherry‑tau；将所述重组质粒pLVX‑mCherry‑tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，获得含有mCherry‑tau基因的慢病毒颗粒；将所述慢病毒颗粒感染HEK293细胞，采用含有嘌呤霉素的培养基对慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry‑tau的细胞系。本发明专利技术构建的细胞系可用于筛选阻断tau表达和聚集的化合物，为开发抑制tau蛋白的表达、聚集、扩散和蔓延，从而治疗AD的药物，提供了一个筛选工具和平台。
A cell line stably expressing mCherry-tau and its construction method and Application
【技术实现步骤摘要】
一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用
本专利技术细胞生物学领域，尤其涉及一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用。
技术介绍
阿尔茨海默症（Alzheimer’sdisease,AD），是最常见的痴呆类型，占老年人痴呆发病率的60%~80%。65岁以上老年人中，每8人就有1人患AD。预计到2050年AD人数将达1.5亿、经济负担将每年达到1万亿美元。中国60岁以上老人中，1.6%患有AD，预计到2050年中国60岁以上老人将达4.38亿，AD将给中国的家庭和社会带来巨大经济负担。tau蛋白与微管结合可发挥正常生物功能，然而，当tau蛋白出现过度磷酸化而从微管上脱落时，则容易聚集形成神经纤维缠结，从而导致多种脑疾病，如阿尔茨海默症（俗称老年痴呆症，缩写AD）。也就是说，tau蛋白的过度表达和聚集及传播，是阿尔茨海默症（AD）的主要病理特征之一。因此，通过筛选抑制tau蛋白表达、聚集和传播的化合物，可用于抗tau病变相关疾病包括AD的药物筛选和研究。因此，现有技术亟需开发出一种能够用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物的方法。
技术实现思路
鉴于上述现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用，旨在解决现有技术缺少用于筛选抑制tau蛋白表达药物的方法的问题。本专利技术的技术方案如下：一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其中，包括步骤：对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau；将所述重组质粒pLVX-mCherry-tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，培养预定时间后，获得含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒；将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其中，所述tau基因片段的制备包括以下步骤：提取人源肾细胞系HEK293细胞中的RNA，并将所述RNA反转录为cDNA，采用正向引物5‘-gacgagctgtacaagatggctgagccccgc-3’以及反向引物5‘-cggttcagtcagtcacaaaccctgcttggccagg-3’对所述cDNA进行PCR扩增，制得PCR产物；对所述PCR产物进行电泳纯化处理，得到纯化的tau基因片段。所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其中，所述对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau的步骤包括：采用非连接酶依赖型单片段快速克隆试剂盒对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，制得重组产物；将所述重组产物转化至大肠杆菌中，在含有氨苄青霉素抗性的平板上培养所述大肠杆菌，通过测序选取含有重组产物的大肠杆菌；对所述含有重组产物的大肠杆菌进行培养并提取质粒，即获得重组质粒pLVX-mCherry-tau。所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其中，所述HEK293T细胞的融合度为70-80%。一种稳定表达mCherry-tau的细胞系，其中，所述细胞系为转入了融合基因mCherry-tau的细胞，所述融合基因mCherry-tau的序列为SEQIDNO.7核苷酸序列。一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其中，将所述稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抗阿尔茨海默症的药物。一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其中，将所述稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物。所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的应用，其中，将稳定表达mCherry-tau的细胞系应用于筛选抑制tau蛋白表达和聚集的药物的步骤包括：将待筛选药物加入到培养液中对所述稳定表达mCherry-tau的细胞系进行培养；在培养预定时间后，通过检测培养液的荧光强度判断所述待筛选药物是否抑制tau蛋白的表达和聚集。有益效果：本专利技术提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，通过将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。利用本专利技术构建的细胞系可用于筛选阻断tau表达和聚集的化合物，为开发抑制tau蛋白的表达、聚集、扩散和蔓延，从而治疗AD的药物，提供了一个筛选工具和平台。附图说明图1为本专利技术一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法较佳实施例的流程图。具体实施方式本专利技术提供一种稳定表达mCherry-tau的细胞系及其构建方法与应用，为使本专利技术的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下对本专利技术进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。请参阅图1，图1为本专利技术提供的一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法较佳实施例的流程图，其中，如图所示，包括步骤：S10、对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau；S20、将所述重组质粒pLVX-mCherry-tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，培养预定时间后，获得含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒；S30、将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。由于tau蛋白出现过度磷酸化时会从微管上脱落，其容易聚集形成神经纤维缠结，从而导致多种脑疾病，如阿尔茨海默症（俗称老年痴呆症，缩写AD）。也就是说，tau蛋白的过度表达和聚集及传播，是阿尔茨海默症（AD）的主要病理特征之一。因此，通过筛选抑制tau蛋白表达、聚集和传播的化合物，可用于抗tau病变相关疾病包括AD的药物筛选和研究。本专利技术构建的细胞系可同时表达荧光蛋白和tau蛋白，通过检测本专利技术细胞系培养液中的荧光表达状况可以筛选阻断tau表达和聚集的化合物，为开发抑制tau蛋白的表达、聚集、扩散和蔓延，从而治疗AD的药物，提供了一个筛选工具和平台。在一些实施方式中，所述tau基因片段的制备包括以下步骤：提取人源肾细胞系HEK293细胞中的RNA，并将所述RNA反转录为cDNA，采用正向引物5‘-gacgagctgtacaagatggctgagccccgc-3’以及反向引物5‘-cggttcagtcagtcacaaaccctgcttggccagg-3’对所述cDNA进行PCR扩增，制得PCR产物；对所述PCR产物进行电泳纯化处理，得到纯化的tau基因片段。其中，用于PCR获取tau基因片段的正向引物如SEQIDNO.1核苷酸序列所示，用于PCR获取ta本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种稳定表达mCherry‑tau的细胞系的构建方法，其特征在于，包括步骤：对tau基因片段和pLVX‑mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX‑mCherry‑tau；将所述重组质粒pLVX‑mCherry‑tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，培养预定时间后，获得含有mCherry‑tau基因的慢病毒颗粒；将所述含有mCherry‑tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry‑tau的细胞系。
【技术特征摘要】
1.一种稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其特征在于，包括步骤：对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau；将所述重组质粒pLVX-mCherry-tau与psPAX2以及pMD2.G混合并转染至HEK293T细胞中，培养预定时间后，获得含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒；将所述含有mCherry-tau基因的慢病毒颗粒感染HEK293细胞，之后采用含有嘌呤霉素的培养基对所述慢病毒颗粒感染的HEK293细胞进行抗性筛选，获得稳定表达mCherry-tau的细胞系。2.根据权利要求1所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其特征在于，所述tau基因片段的制备包括以下步骤：提取人源肾细胞系HEK293细胞中的RNA，并将所述RNA反转录为cDNA，采用正向引物5‘-gacgagctgtacaagatggctgagccccgc-3’以及反向引物5‘-cggttcagtcagtcacaaaccctgcttggccagg-3’对所述cDNA进行PCR扩增，制得PCR产物；对所述PCR产物进行电泳纯化处理，得到纯化的tau基因片段。3.根据权利要求1所述稳定表达mCherry-tau的细胞系的构建方法，其特征在于，所述对tau基因片段和pLVX-mcherry载体进行同源重组，获得重组质粒pLVX-mCherry-tau的步骤包括：采用非连接酶依赖型单片段快速克...
【专利技术属性】
技术研发人员：陈杰瑞，刘琼，肖时峰，李楠，
申请(专利权)人：深圳大学，
类型：发明
国别省市：广东,44
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