一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种用于制备CAR‑T的慢病毒载体质粒及其制备方法和用途，含有双启动子；酶切位点充足，易于插入基因；含有T2A序列，T2A序列能使连接的两个基因同时表达；本发明专利技术的用于制备CAR‑T的慢病毒载体，酶切位点充足，组件丰富，易于改造，方便载体的构建；本发明专利技术的用于制备CAR‑T的慢病毒载体应用广泛，可用于构建单CAR及多CAR、表达自杀基因或筛选基因等，也可用于构建表达细胞因子的第四代CAR，能满足CAR‑T中慢病毒载体质粒同时表达多个基因的要求；利用该慢病毒载体包装的慢病毒滴度高，利用该慢病毒载体质粒制备的慢病毒感染T细胞的效率高，并且制备的CAR‑T细胞具有较大的杀伤力。

A lentivirus vector for preparation of CAR-T and its construction method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用
本专利技术涉及慢病毒载体
，具体说是一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用。
技术介绍
随着免疫学、分子生物学和基因工程技术的发展，人们对恶性肿瘤细胞治疗模式的认识日新月异，尤其是嵌合抗原受体T细胞疗法(ChimericAntigenReceptorT-CellImmunotherapy；CAR-T)在白血病和实体肿瘤领域的探索和应用，使人们看到了治愈恶性肿瘤的希望，其原理是，从癌症病人身上分离免疫T细胞，利用基因工程技术在T细胞表面表达由肿瘤抗原特异性单链抗体(scFv)和T细胞受体胞内成分组成的嵌合抗原受体(CAR-T细胞)，通过体外培养大量扩增CAR-T细胞并输回病人体内，CAR-T细胞特异性识别并杀伤带有特定抗原的肿瘤细胞并引发免疫反应从而达到治疗肿瘤的效果。在CAR-T细胞治疗中，基因载体系统的构建具有举足轻重的作用，它关系到CAR在T细胞表面的表达效率，进而关系到CAR-T细胞治疗恶性肿瘤的效果。对于CAR-T构建来说，慢病毒是目前最常用的导入CAR基因的工具。优秀的慢病毒载体质粒是CAR-T细胞制备的关键环节之一，由于慢病毒载体质粒启动子的不同导致启动CAR基因表达的效率不同，甚至影响病毒转染T细胞的效率。CAR-T对慢病毒载体质粒同时表达多个基因提出了较高的要求，如除导入CAR基因外，CAR-T细胞内有时还需要导入自杀基因以建立风险控制机制，或者导入多个CAR针对多个肿瘤靶点防止肿瘤细胞逃逸，或者表达细胞因子以构建增强CAR-T等，因此含有多个启动子和酶切位点，组件丰富，易于改造，方便治疗载体构建的慢病毒载体亟待开发。
技术实现思路
为解决上述问题，本专利技术的目的是提供一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用。本专利技术为实现上述目的，通过以下技术方案实现：一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，含有hPGK和hUbC双启动子；酶切位点充足，易于插入基因；含有T2A序列，T2A序列能使连接的两个基因同时表达；所述酶切位点为XbaI、NdeI、SalI、BamHI、NsiI、PstI和KpnI；其基因序列为SEQIDNO：3。优选的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，慢病毒载体质粒携带并表达单个CAR基因、或多个CAR基因、或含有CAR基因与其他基因，所述的其他基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。本专利技术还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的构建方法，包括以下步骤：①以PlentiPGKGFPPuro为起始载体，通过BamHI和KpnI酶切，切下含有hPGKpromoter、cPPT/CTS、RRE、5’-LTR、ori、Amp、3’-LTR组件的长片段Fragment1，切胶回收，备用；其中Fragment1的基因序列为SEQIDNO：1；②合成基因片段Fragment2，基因片段Fragment2中含有以下酶切位点或组件：BamHI、SalI、2A、NdeI、XbaI、WPRE、hUbC、NsiI、PstI、NsiI和KpnI；Fragment2的基因序列为SEQIDNO：2；③BamHI和KpnI酶切Fragment2，切胶回收，与步骤①的切胶回收产物连接，连接产物转化Stbl3感受态，涂布平板，挑取单菌落至LB培养基中，培养10～15小时；④质粒小提，BamHI和KpnI酶切验证目的条带，目标条带的大小为1.947kb，质粒测序验证，得到慢病毒载体pLC，大小为7.967kb，pLC的基因序列为SEQIDNO：3。本专利技术还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在构建携带单个CAR基因的质粒中的应用。本专利技术还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在构建携带多个CAR基因的质粒中的应用。本专利技术还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在构建携带CAR基因和其它基因的质粒中的应用，其中其它基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。所述细胞因子如IL-2、IL-12、IL-7或IL-15等；所述趋化因子如CCL19等；所述自杀基因为iCasp9等；所述筛选基因为嘌呤霉素抗性基因、EGFP基因等。本专利技术还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在制备用于CAR-T的慢病毒中的应用。本专利技术还包括一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，在制备CAR-T细胞中的应用。本专利技术相比现有技术具有以下优点：本专利技术的用于制备CAR-T的慢病毒载体，含有hPGK或hUbC双启动子，T2A序列等，酶切位点充足，组件丰富，易于改造，方便载体的构建；本专利技术的用于制备CAR-T的慢病毒载体应用广泛，可用于构建单CAR及多CAR、表达自杀基因或筛选基因等，也可用于构建表达细胞因子的第四代CAR，能满足CAR-T中慢病毒载体质粒同时表达多个基因的要求；利用该慢病毒载体包装的慢病毒滴度高，利用该慢病毒载体质粒制备的慢病毒感染T细胞的效率高，并且制备的CAR-T细胞具有较大的杀伤力。本专利技术的用于制备CAR-T的慢病毒载体的构建方法，流程少，步骤易实施。附图说明图1为Fragment1的组成示意图；图2为基因片段Fragment2的组成示意图；图3为慢病毒载体pLC的图谱示意图；图4为慢病毒载体质粒pLC的构建过程示意图。具体实施方式本专利技术的目的是提供一种用于制备CAR-T的慢病毒载体及其构建方法和应用，通过以下技术方案实现：一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的构建方法，如图4所示，包括以下步骤：①以PlentiPGKGFPPuro(W509-5)为起始载体，通过BamHI和KpnI酶切，切下含有hPGKpromoter、cPPT/CTS、RRE、5’-LTR、ori、Amp、3’-LTR组件的长片段Fragment1，切胶回收，备用；Fragment1的基因序列为SEQIDNO：1；如图1所示的Fragment1，其中LTR、HIV-1ψ、RRE、cPPT/CTS为慢病毒载体质粒中的常见序列。AmpR为氨苄抗性基因，AmpRpromoter为氨苄抗性基因启动子，连同ori(复制起点)及lacpromoter等为质粒常规组件；hPGKpromoter指磷酸甘油酸激酶-1基因的启动子；②合成基因片段Fragment2，如图2所示，基因片段Fragment2中含有以下酶切位点或组件：BamHI、SalI、T2A、NdeI、XbaI、WPRE、Promoter2、NsiI、PstI、NsiI、KpnI；T2A序列编码2A肽，T2A序列连接2个基因，利用T2A序列的自剪切作用，可以实现两个基因的同时表达，FactorXasite为常规组件，非必需，hUbCpromoter为人聚泛素启动子-C；其中Fragment2的基因序列为SEQIDNO：2；③BamHI和KpnI酶切Fragment2，切胶回收，与步骤①的切胶回收产物连接，(连接方法参照T4DNAligase说明书所附方法)，连接产物转化Stbl3感受态，涂布平板，挑取单菌落至LB培养基中，培养10～15小时；④质粒小提，BamHI和KpnI酶切验证目的条带，大小约为2kb，质粒测序验证，得到慢病毒载体pLC，大小约为8kb，pLC的基因序列为S本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于制备CAR‑T的慢病毒载体质粒，其特征在于：含有hPGK和hUbC双启动子；酶切位点充足，易于插入基因；含有T2A序列，T2A序列能使连接的两个基因同时表达；所述酶切位点为XbaI、NdeI、SalI、BamHI、NsiI、PstI和KpnI；其基因序列为SEQ ID NO：3。

【技术特征摘要】
2019.04.25 CN 20191033661011.一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，其特征在于：含有hPGK和hUbC双启动子；酶切位点充足，易于插入基因；含有T2A序列，T2A序列能使连接的两个基因同时表达；所述酶切位点为XbaI、NdeI、SalI、BamHI、NsiI、PstI和KpnI；其基因序列为SEQIDNO：3。2.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒，其特征在于：在双启动子及T2A序列的作用下，慢病毒载体质粒能够最多同时表达3个基因；该慢病毒载体质粒中携带并表达单个CAR基因、或多个CAR基因或含有CAR基因与其他基因，所述的其他基因为细胞因子、趋化因子、自杀基因或筛选基因。3.权利要求1的一种用于制备CAR-T的慢病毒载体质粒的构建方法，其特征在于：包括以下步骤：①以PlentiPGKGFPPuro为起始载体，通过BamHI和KpnI酶切，切下含有hPGKpromoter、cPPT/CTS、RRE、5’-LTR、ori、Amp、3’-LTR组件的长片段Fragment1，切胶回收，备用；其中Fragment1的基因序列为SEQIDNO：1；②合成基因片段Fragment2，基因片段Fragment2中含有以...

【专利技术属性】
技术研发人员：张文，刘江，唐东起，
申请(专利权)人：山东大学第二医院，
类型：发明
国别省市：山东,37