一种LRFF细胞的构建方法技术

本发明专利技术使用患者外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点进行抗原表位预测，连接并合成突变多肽表达基因序列；同时构建慢病毒载体，包装慢病毒，转染APC细胞，完成特异性LV细胞的改造，体外与从外周血中分离的PBMC共培养，筛选出有效的精准多肽，通过精准多肽刺激的第二次冲击，将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的LRFF细胞，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。发明专利技术提供的LRFF细胞可广泛应用于个体化精准治疗实体肿瘤。

A Construction Method of LRFF Cells

【技术实现步骤摘要】
一种LRFF细胞的构建方法
本专利技术属于生物
，具体涉及一种LRFF细胞的构建方法。
技术介绍
目前，在肿瘤的特异性免疫治疗方面，现有的LAK、DC、CIK、DC-CIK细胞和方法基本被证明是无效的，而NK、CAR-NK、TIL等细胞技术还有待成熟，CAR－T细胞在安全性和实体瘤治疗中还有缺陷。现有技术一般通过改造DC细胞，由DC递呈T细胞产生特异杀伤。有些实验室在尝试用病毒做为载体的方法进行转染递呈T细胞，诱导T细胞的特异性杀伤。我们也曾用突变混合多肽直接刺激PBMC，诱导T细胞。以上治疗方法都有局限性，尤其是体外诱导DC细胞及DC细胞负载肿瘤抗原技术理论上研究较多，但在具体实施过程中还有许多问题，缺乏明确的、肿瘤细胞发生发展关键的信号传导通路相关分子作为诱导抗原，因为肿瘤抗原不明及肿瘤微环境免疫抑制的障碍，使实现特异性细胞靶向免疫治疗难以顺利实施。另外，有的虽然进行了抗原体外冲击，但没有进行体外共培育和体外扩增，让较为单薄的特异性细胞直接面对复杂的肿瘤免疫微环境，因此，很难起到预期的效果。也有的虽然也可以体外递呈和共培育，但靶点单一(MAGE-3)，仅对非小细胞肺癌等个别癌种起效。虽然也有尝试慢病毒为载体的方法进行转染递呈，但安全性、方便性不如多肽方式。而简单混合多肽的直接刺激，虽然简单方便，但效率较低。上述方案普遍缺乏对患者抗原准确有效的分析，更有效的方式应该是既要考虑安全性问题，又要兼顾抗原递呈效率，这样才能达到精准治疗的目的。
技术实现思路
本专利技术使用患者外周血进行ctDNA测序或肿瘤组织进行全外显子测序，筛选出突变位点进行抗原表位预测，连接并合成突变多肽表达基因序列；同时构建慢病毒载体，包装慢病毒，转染APC细胞，完成特异性LV细胞的改造，体外与从外周血中分离的PBMC共培养，筛选出有效的精准多肽，通过精准多肽刺激的第二次冲击，将普通T细胞改造成为具有更精准杀伤能力的LRFF细胞，提高了T细胞对肿瘤细胞的杀伤力。本专利技术提供的LRFF细胞可广泛应用于个体化精准治疗实体肿瘤。对于专用名词的解释：L：慢病毒转染技术R：精准多肽二次冲击技术FF：混合多肽技术例如：LRFF细胞，即经由上述L、R、FF各项技术方案或技术手段改造而最终获得的细胞。LRFF细胞改造方案概述如下：1、抗原表位预测1)使用人源外周血进行ctDNA测序或市售工程细胞系(如H1299、H226、H358、H1563、H2228、A549、Renca、LLC小鼠Lewis肺癌细胞、CRL-6323B16F1、CRL-25394T1、U14小鼠子宫颈癌细胞、BV-2小鼠小胶质瘤细胞、G422小鼠神经胶质瘤细胞等)进行MHC类型检测和全外显子测序检测RNA突变；2)利用MHC类型和基因突变信息预测抗原表位：以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位；3)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；2、多肽连接1)使用前述软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，可以连接；IC50＜1000nM时认为是强免疫原性，不能连接；2)根据上述结果，将弱免疫原性的抗原表位连接在一起，接头处IC50要高于两侧抗原表位的IC50(也就是接头处尽量避免产生强结合抗原)；3、合成编码多肽的基因序列1)将连接后的多肽还原为核酸序列，并进行密码子优化；2)使用固相合成法合成抗原表位肽的基因序列；或由技术服务公司进行合成；4、慢病毒包装将上步合成的基因序列构建表达抗原表位肽的慢病毒表达质粒后，进行慢病毒包装；5、转染抗原递呈细胞(APC)并与PBMC共培养1)使用表达抗原表位肽的慢病毒转染抗原递呈细胞(包括但不限于：外周血单个核细胞、树突状细胞、中性粒细胞、B淋巴细胞、巨噬细胞)；2)收集处理完成的APC，以APC：PBMC＝1：5-20的比例混合共培养，得到效应细胞；6、筛选有效的精准多肽，并使用精准多肽再次刺激T细胞1)离心收集以上方案获得的T细胞，多肽作为抗原直接刺激T细胞筛选精准多肽：2)设置阳性对照：T细胞+100ng/mLOKT3；阴性对照：T细胞+1640+10％FBS+200U/mLIL2；3)精准多肽评判标准：a.阳性对照和阴性对照正常，则说明此数据可信；b.实验组显著大于阴性对照组的为有效的精准多肽；4)以筛选出的精准多肽二次冲击T细胞，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，即得LRFF细胞；7、构建特异性抗原表达靶细胞及肿瘤模型生存实验。本专利技术的有益效果：1.本专利技术新型特异性LRFF细胞，在LV细胞的基础上，找出精准多肽进行二次刺激，更好地解决了患者免疫细胞不能准确识别和杀伤肿瘤细胞的问题，同时弥补了LV细胞和RFF细胞的不足，RFF的杀伤效率不如LRFF细胞，LV细胞的特异性不如LRFF细胞。2.肿瘤抗原为突变抗原，与其它组织不同，靶点专一性强，不易发生脱靶效应，安全性高；3.获得的特异性细胞比例高，通常能够识别肿瘤抗原的特异性细胞，在PBMC的分布为0.5％以下，经过LRFF方案改造的细胞，识别肿瘤抗原的特异性T细胞(TCR+)比例为10％以上。附图说明图1：慢病毒转染APC效率检测；其中，1A：对照组，1B：转染组。图2：LRFF细胞分型检测。图3：精准多肽的筛选。图4：流式检测特异性T细胞比例；其中，4A：对照组，4B：LRFF方案。图5：LDH释放检测细胞杀伤效率。图6：ELISA检测细胞因子IFN-γ的释放。图7：动物荷瘤模型生存曲线。具体实施方式下面通过具体的实施方案叙述本专利技术。除非特别说明，本专利技术中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本专利技术的范围，本专利技术的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本专利技术实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本专利技术的保护范围。技术方案详述如下：1、抗原表位预测1)使用肺癌患者外周血进行ctDNA测序和HLA分型检测；2)利用软件对测序信息进行分析：将ctDNA测序结果与正常细胞的基因组相比，筛选出突变位点；3)以突变的氨基酸位点为中心，向两侧延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位；4)使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50(推荐软件：NetMHCpan3.0、PickPocket、artificialneuralnetworks(ANN))，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位。2、多肽连接1)使用前述软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，可以连接；IC50＜1000nM时认为是强免疫原性，不能连接(此处应考虑3个预测软件的IC50计算结果，当≥2个软件计算的IC50≥1000nM时才能认为是弱免疫原性，当≥2个软件计算的IC50＜1000nM时才能认为是强免疫原性)；2)根据上述结果，将抗原表位连接在一起，接头处IC50要高于两侧抗原表位的IC50(也就是接头处尽量避免产生强结合抗原)；必要时将弱免疫原性肽做为连接肽将强免疫原性肽间本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种LRFF细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：1)通过测序肿瘤细胞筛选出突变位点，以突变的氨基酸位点为中心，向两侧各延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位，使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；2)使用上步软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，将弱免疫原性的抗原表位连接在一起，合成连接后的突变多肽的基因序列；3)构建表达突变多肽的慢病毒载体，包装慢病毒；4)使用所述慢病毒转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得LFF细胞；5)所述突变多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，通过检测IFN‑γ的分泌，筛选出有效的精准多肽；6)以所述精准多肽作为抗原再次刺激所述LFF细胞，以流式细胞仪进行分选，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，即得LRFF细胞。

【技术特征摘要】
2018.09.30 CN 20181115322741.一种LRFF细胞的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：1)通过测序肿瘤细胞筛选出突变位点，以突变的氨基酸位点为中心，向两侧各延伸8个氨基酸，将这段17个氨基酸的多肽作为潜在抗原表位，使用预测软件分析潜在抗原表位的IC50，如IC50＜1000nM则认为此潜在抗原表位为抗原表位；2)使用上步软件分析任意抗原表位两两相连后接头处的IC50，IC50≥1000nM时认为是弱免疫原性，将弱免疫原性的抗原表位连接在一起，合成连接后的突变多肽的基因序列；3)构建表达突变多肽的慢病毒载体，包装慢病毒；4)使用所述慢病毒转染抗原递呈细胞并与PBMC共培养，获得LFF细胞；5)所述突变多肽作为抗原刺激所述LFF细胞，通过检测IFN-γ的分泌，筛选出有效的精准多肽；6)以所述精准多肽作为抗原再次刺激所述LFF细胞，以流式细胞仪进行分选，筛选出能够识别所述精准多肽的特异性细胞，即...

【专利技术属性】
技术研发人员：焦顺昌，张嵘，张天赋，周子珊，解佳森，王海燕，吴子明，
申请(专利权)人：北京鼎成肽源生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11