增加塑料降解的蛋白酶制造技术

本发明专利技术涉及新型蛋白酶，更具体地，涉及与SEQ ID NO：1的蛋白酶相比具有改进活性的蛋白酶变体，及其用于降解含聚酯材料如塑料产品的用途。本发明专利技术的蛋白酶特别适于降解聚乳酸和含聚乳酸的材料。

Increasing Plastic Degradation Protease

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】增加塑料降解的蛋白酶
本专利技术涉及新型蛋白酶，更具体地，涉及与亲本蛋白酶相比具有改进活性的蛋白酶及其用于降解含聚酯材料如塑料产品的用途。本专利技术的蛋白酶特别适于降解聚乳酸和含聚乳酸的材料。
技术介绍
蛋白酶能够催化多种聚合物(包括聚酯)的水解。在这种情况下，蛋白酶在许多工业应用中显示出有希望的效果，包括作为洗碗和洗衣应用的洗涤剂，作为用于处理生物质和食品的降解酶，作为环境污染物解毒中的生物催化剂或用于处理纺织工业中的聚酯织物。同样，使用蛋白酶作为水解聚乳酸(PLA)的降解酶特别令人感兴趣。实际上，PLA是用于许多
的一种生物基聚合物，例如柔性和刚性包装、袋子、覆盖薄膜，以及制造衣服和地毯。因此，填埋场中的PLA积聚成为一个日益严重的生态问题。在蛋白酶中，丝氨酸蛋白酶(EC3.4.21)是切割蛋白质中的肽酰胺键的酶，其中丝氨酸用作酶活性位点中的亲核氨基酸。丝氨酸蛋白酶在真核生物和原核生物中普遍存在。许多细菌丝氨酸蛋白酶最初在芽孢杆菌(Bacillus)中被鉴定，最近也在其他嗜常温宿主中被鉴定。然而，已经从嗜热和超嗜热细菌中分离越来越多的丝氨酸蛋白酶。例如，来自水生栖热菌(Thermusaquatic)YT-1的aqualysinI已被克隆、测序并在大肠杆菌(Escherichiacoli)中表达。生物降解，尤其是酶降解，被认为是减少塑料废物积聚的令人感兴趣的解决方案。实际上，酶能够加速含聚酯材料，尤其是塑料产品的水解，甚至低至单体水平。此外，水解物(即单体和低聚物)可以作为合成新聚合物的材料回收。最近，已开发出新的塑料材料，其整合了适于降解塑料材料的至少一种聚合物的生物实体，从而产生可生物降解的塑料产品。例如，已经生产出含有蛋白酶的由PLA制成的塑料产品。这种可生物降解的塑料可以至少部分地解决填埋场和自然栖息地中塑料堆积的问题。在这种情况下，已经鉴定了几种蛋白酶作为候选降解酶。例如，已经描述了小单孢菌属(Micromonosporasp.)(WO2016/146540)的蛋白酶降解聚酯，更特别是聚乳酸的能力。然而，仍然需要在高温下具有改进的活性和/或改进的稳定性的蛋白酶，使得降解过程效率更高，从而提高可生物降解塑料生产过程、生物聚酯降解过程和/或生物回收过程的竞争力。专利技术简述本专利技术提供了新型蛋白酶，其是亲本或野生型蛋白酶的变体，与所述野生型蛋白酶相比显示出增加的聚酯降解活性。更具体地，本专利技术提供了具有SEQIDNO:1所示氨基酸序列的亲本蛋白酶的变体，其对应于UniProtKB中称为P80146的氨基酸序列的133-410位氨基酸，并且其对应于Munro等，1995Jul,Microbiology,141(Pt7):1731-8描述的成熟蛋白酶的氨基酸序列(来自栖热菌属(Thermussp.)菌株Rt41A的碱性丝氨酸蛋白酶)，并且在Munro等，1995中描述为在70℃下表现出超过24小时的稳定性。野生型蛋白酶和变体都被认为是枯草杆菌蛋白酶样蛋白酶。本专利技术的蛋白酶特别适用于降解塑料材料和产品，例如含有聚乳酸(PLA)的塑料材料和产品的方法。因此，本专利技术进一步提供了使用蛋白酶来降解含有聚乳酸(PLA)的塑料材料和产品的方法，所述蛋白酶与SEQIDNO：1所示的氨基酸具有至少75％、80％、85％、90％、95％、99％、100％的同一性，并且与SEQIDNO:1相比，可能在特定氨基酸上具有一个或多个取代。在这方面，本专利技术的一个目的是提供一种蛋白酶变体，其(i)与SEQIDNO：1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性，和(ii)具有至少一个选自以下位置的取代：N102、S104、S106、N107、G132、G134、D160或Y167，其中所述位置参考SEQIDNO:1所示的氨基酸序列编号。有利地，与SEQIDNO:1的蛋白酶相比，所述蛋白酶变体表现出聚酯降解活性，并且优选增加的聚酯降解活性。在一个具体的实施方案中，蛋白酶包含至少一个在S104位置的取代。根据一个具体的实施方案，蛋白酶可以包含至少一种选自以下取代的组合：S104L+N107I、S104L+Y167R、D160E+Y167R、N102S+D160E+Y167R、S106T+D160E+Y167R、N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+D160E+Y167R、S106T+N107T+D160E+Y167R、N102S+N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I、N102F+S104L+D160E+Y167R、N102F+S104L+N107I+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G132I、N102F+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+Y167R和N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+D160E+Y167R，其中所述位置参考SEQIDNO:1所示的氨基酸序列编号。本专利技术的另一个目的是提供编码本专利技术的蛋白酶的核酸。本专利技术还涉及包含所述核酸的表达盒或表达载体，和包含所述核酸、表达盒或载体的宿主细胞。本专利技术的进一步目的是提供产生本专利技术的蛋白酶的方法，包括：(a)在适于表达编码蛋白酶的核酸的条件下培养根据本专利技术的宿主细胞；和任选地(b)从细胞培养物回收所述蛋白酶。本专利技术还涉及降解包含至少一种聚酯，优选PLA的塑料产品的方法，包括：(a)将塑料产品与根据本专利技术的蛋白酶或宿主细胞接触，从而降解所述塑料产品；和任选地(b)回收单体和/或低聚物，优选乳酸(LA)的单体和/或低聚物。本专利技术还涉及含有聚酯的材料，其包含根据本专利技术的蛋白酶或宿主细胞。更优选地，本专利技术涉及含有聚乳酸(PLA)的材料，其包含根据本专利技术的蛋白酶或宿主细胞。本专利技术还提供一种生产这种含有聚酯的材料的方法，该方法包括混合聚酯(优选PLA)和本专利技术的蛋白酶或宿主细胞的步骤，其中混合步骤在聚酯处于部分或完全熔融状态的温度下，优选在挤出过程中进行。本专利技术的另一个目的是提供含有聚酯的材料，更优选含有PLA的材料，其包含具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的蛋白酶。本专利技术还提供一种生产这种含有聚酯的材料的方法，该方法包括混合聚酯(优选PLA)和具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的蛋白酶的步骤，其中混合步骤在聚酯处于部分或完全熔融状态的温度下，优选在挤出过程中进行。本专利技术进一步涉及如上所述的蛋白酶变体和/或具有SEQIDNO：1所示氨基酸序列的蛋白酶用于降解含聚酯材料，更优选含PLA材料的用途。专利技术详述定义通过参考以下定义将最好地理解本公开。本文中，术语“肽”、“多肽”、“蛋白质”、“酶”是指通过肽键连接的氨基酸链，而不管形成所述链的氨基酸的数量。根据以下命名法，本文中的氨基酸由它们的单字母或三字母代码表示：A：丙氨酸本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.蛋白酶变体，其(i)与SEQ ID NO：1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性，和(ii)具有至少一个选自以下位置的取代：S104、N102、S106、N107、G132、G134、D160或Y167，其中所述位置参考SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列编号。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.16 EP 16306702.81.蛋白酶变体，其(i)与SEQIDNO：1所示的全长氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％或99％的同一性，和(ii)具有至少一个选自以下位置的取代：S104、N102、S106、N107、G132、G134、D160或Y167，其中所述位置参考SEQIDNO:1所示的氨基酸序列编号。2.根据权利要求1所述的蛋白酶变体，其(iii)表现出聚酯降解活性，优选与SEQIDNO:1的蛋白酶相比聚酯降解活性增加。3.根据权利要求1或2所述的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶包含至少一个在S104位置的取代，其中所述位置参考SEQIDNO:1所示的氨基酸序列编号。4.根据权利要求1-3任一项所述的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶包含至少一个选自N102S/F、S104L、S106T、N107T/I、G132I、G134K、D160E和Y167R，优选选自N102F、S104L、S106T和N107I，更优选选自S106T和S104L的氨基酸取代。5.根据权利要求1-4任一项所述的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶包含至少一种选自以下的取代的组合：S104L+N107I、S104L+Y167R、D160E+Y167R、N102S+D160E+Y167R、S106T+D160E+Y167R、N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+D160E+Y167R、S106T+N107T+D160E+Y167R、N102S+N107T+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I、N102F+S104L+D160E+Y167R、N102F+S104L+N107I+D160E+Y167R、N102S+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G132I、N102F+S106T+N107T+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+D160E+Y167R、N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+Y167R和N102F+S104L+S106T+N107I+G132I+D160E+Y167R，其中所述位置参考SEQIDNO:1的氨基酸序列编号。6.根据权利要求1-3任一项所述的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶包含选自N102S/F、S104L、S106T、N107T/I、G132I、G134K、D160E和Y167R，更优选选自N102F、S104L、N107I、G132I、G134K和Y167R，甚至更优选选自S104L和Y167R的单个氨基酸取代。7.根据权利要求1-6任一项所述的蛋白酶变体，其中所述蛋白酶在N-末端包含其他序列，所述氨基酸序列与SEQIDNO：42所示的全长氨...

【专利技术属性】
技术研发人员：A·马蒂，S·迪奎斯内，M·吉谢尔，M·维耶曼，M·本·卡勒德，
申请(专利权)人：卡比奥斯公司，
类型：发明
国别省市：法国,FR