新的生物素特异性单克隆抗体及其用途制造技术

本发明专利技术涉及能够与生物素结合的单克隆抗体。在一个实施方案中，根据本发明专利技术的单克隆抗体也不与生物素化的分子上的生物素部分结合，其中所述生物素部分通过生物素的戊酸部分的羧基官能的碳原子与所述分子附着。还公开了用于产生本文公开的抗体的方法。根据本发明专利技术的单克隆抗体对用于测量样品中分析物的方法有特殊用处，其中（链霉）抗生物素蛋白/生物素对用于将生物素化的分析物特异性结合剂结合到（链霉）抗生物素蛋白包被的固相上。

New biotin-specific monoclonal antibodies and their applications

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】新的生物素特异性单克隆抗体及其用途本专利技术涉及能够与生物素结合的单克隆抗体。在一个实施方案中，根据本专利技术的单克隆抗体也不与生物素化的分子上的生物素部分结合，其中所述生物素部分通过生物素的戊酸部分的羧基官能的碳原子与所述分子附着。还公开了用于产生本文公开的抗体的方法。根据本专利技术的单克隆抗体对用于测量样品中分析物的方法有特殊用处，其中（链霉）抗生物素蛋白/生物素对用于将生物素化的分析物特异性结合剂结合到（链霉）抗生物素蛋白包被的固相上。专利技术背景在活的生物以及在体外生物化学中，生物素的主要功能是共底物的功能，其作为具有羧基转移酶活性的酶的辅基是需要的，例如，丙酮酸羧化酶和乙酰辅酶A羧化酶。在细菌中，生物素通过生物素蛋白连接酶与生物素羧基载体蛋白附着。此外，已知许多化学过程，生物素可以借助所述化学过程共价附着到几乎任何感兴趣的分子上的合适基团。作为共同特征，戊酸侧链的羧基官能的碳原子在偶联反应中与感兴趣的分子上的适当（接收）基团反应，或与接头的反应基反应，其中接头本身或者已经连接到感兴趣的分子，或者一旦生物素附着到接头，接头就与分子偶联。通常，通过戊酸侧链的羧基官能的碳原子将生物素到各种化学位点的这种附着被称为生物素化。抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白（=（链霉）抗生物素蛋白）分别对生物素的非凡亲和力（Ka=1015M-1）是蛋白质和配体的最强已知非共价相互作用之一。它允许复杂混合物中的生物素化的分子被（链霉）抗生物素蛋白特异性结合。由于这个原因，抗生物素蛋白和/或链霉抗生物素蛋白用于大量免疫学检测测定中。除了对（链霉）抗生物素蛋白具有强亲和力外，两个进一步的性质使生物素特别适合于标记蛋白质和其他大分子。首先，生物素分子显著小于蛋白质。其分子大小允许一个或多个生物素分子与感兴趣的分子缀合，同时使这种分子的生物功能损失减至最小。其次，生物素的戊酸侧链的末端碳原子可以容易地衍生化，从而促进与感兴趣的分子，特别是蛋白质上的反应性部分的缀合。值得注意的是，生物素化不改变生物素的杂环部分的结构。在通过戊酸侧链的末端碳原子进行生物素化后，生物素部分保持了与（链霉）抗生物素蛋白特异性相互作用的能力，这是因为负责与抗生物素蛋白型蛋白质的结合口袋的特异性相互作用的生物素分子的部分是由与四氢噻吩环稠合的脲基环代表的杂环结构不受影响。生物素的杂环结构也被现有技术中针对生物素的单克隆抗体（mAbs）靶向。KohenF.等人（MethodsinEnzymology279(1997)451-463）使用生物素化的牛血清清蛋白（与N-羟基琥珀酰亚胺生物素缀合的BSA）作为免疫原产生单克隆抗体。该文献报道了能够结合生物素化的蛋白质的生物素部分的抗体的抗原结合区域的氨基酸序列的分析。与据报道与生物素的二环环状系统相互作用的抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白多肽序列的同源序列段进行了序列比对。值得注意的是，在生物素特异性抗体的CDR2和CDR3中鉴定了与抗生物素蛋白和链霉抗生物素蛋白的多肽序列的相似性。结果解释为因为在生物素结合口袋的氨基酸序列中，共同模式是生物素结合所必需的。Dakshinamurti,K等人（Biochem.J.237(1986)477-482）报道了使用偶联有活化形式的生物素（N-羟基琥珀酰亚胺生物素）的匙孔䗩血蓝蛋白（KLH）作为免疫原的鼠mAbs的产生和表征。获得了几种杂交瘤克隆，并且各自的mAbs在结合游离的生物素、半抗原缀合的生物素、蛋白质缀合的生物素和生物胞素中有效。值得注意的是，生物胞素是天然存在的生物素衍生物，是由戊酸羧基官能和氨基酸L-赖氨酸形成的酰胺。这种衍生化的生物素被Dakshinamurti,K等人（见上）的mAbs结合的事实指示了靶向生物素的杂环结构（即，与四氢噻吩环稠合的脲基环）的结合特异性。虽然Dakshinamurti,K等人（见上）报道的mAbs的确结合缀合的生物素且也结合游离的生物素，但JP2008-094721公开了一种mAb，其特异性结合蛋白质缀合的生物素，但不与游离生物素结合。表1总结了现有技术抗体的讨论的性质。表1针对生物素产生的单克隆抗体的结合性质报道与生物素化的靶结合与游离生物素结合Dakshinamurti,K等人（Biochem.J.237(1986)477-482）是是KohenF.等人（M.Enzymol.279(1997)451-463）是未测定JP2008-094721是否尚无报道否是类似于Dakshinamurti,K等人（见上）的报道，WO00/50088A2涉及具有可比较的性质的抗体；具体而言，报道了对缀合的生物素具有的亲和力比对游离生物素的相应亲和力高一至四个数量级的抗体。该文献公开了用抗原进行免疫，生物素通过戊酸部分的羧基官能的碳原子与所述抗原缀合。在第一筛选步骤中，鉴定了与缀合的生物素结合的抗体；公开了后来的第二筛选步骤，其旨在鉴定即使在有限定量的游离生物素的情况下也分泌能够结合缀合的生物素的单克隆抗体的克隆。值得注意的是，该文献没有提到这样的单克隆抗体，所述单克隆抗体一方面与游离生物素（不与另一分子共价结合并且在水溶液中处于解离形式的生物素）结合，但另一方面不与生物素化的分子上的生物素部分结合，即，也可以被（链霉）抗生物素蛋白结合的生物素部分。IndykH.E.等人InternationalDairyJournal35（2014）25-31报道了一种用于检测乳中游离生物素的光学生物传感器测定。使用具有CM5传感器芯片的BiacoreQ生物传感器；在胺修饰的传感器表面上，生物素通过其NHS-活化的戊酸末端羧基的共价偶联来固定。值得注意的是，与传感器芯片偶联的生物素分子的取向与生物素化的分子上的生物素相同，即，对应于也可以被（链霉）抗生物素蛋白结合的生物素部分。因此，主要暴露生物素的杂环结构用于抗体结合。在有不同浓度的游离生物素作为竞争剂的情况下，使用生物素传感器芯片表征了三种不同生物素特异性多克隆抗体和两种不同单克隆抗体的结合性质。值得注意的是，到现在为止，在现有技术中还没有发现描述特异性结合游离生物素而不是生物素化的靶分子上缀合的生物素的单克隆抗体的公开内容。这种抗体将主要从其“尾”结合生物素，即，将显著地与生物素的戊酸部分相互作用。特别地，到现在为止，尚未描述这样的抗体，其一方面特异性结合游离生物素，但另一方面不结合缀合的生物素，其中缀合的生物素通过戊酸部分的羧基官能的碳原子与靶分子附着，由此生物素的杂环“头”结构位于远离靶分子处。此外，到现在为止，没有这样的单克隆抗体是已知的，其在水溶液中表征为对游离生物素的亲和力Ks[游离]高于相同单克隆抗体对缀合的生物素的亲和力Ks[缀合]，其中所述缀合的生物素通过戊酸部分的羧基官能的碳原子缀合（参见上文），并且其中Ks[游离]与Ks[缀合]相差至少50、100、500、1,000、5,000、10,000、50,000或至少100,000倍。JohnsonL.C.（“Thesynthesisofnewbiotinderivativesandtheirbioactivity”，于2017年2月16日从因特网检索的提交到GraduateFacultyoftheLouisianaStateUniver本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.特异性结合式I化合物的单克隆抗体，

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.12.27 EP 16206944.7;2017.07.31 EP 17184141.4;1.特异性结合式I化合物的单克隆抗体，（式I）其特征在于它还与生物素结合，其中Y选自O、S和CH2，X选自(CH2)n，其中n为1至20的整数，[(CH2)p-O]k-(CH2)m，其中p为2或3，m为2或3，且k为1至30的整数，以及[(CH2)r-CONH]s-(CH2)t，其中r为1至5的整数，t为0至5的整数，且s为1至5的整数且R选自H、OH、COOH、H2N、HO、叠氮基、马来酰亚胺基和Z，其中Z是A或B，其中A是M-L，且其中B是其中M选自（i）不含生物素部分的半抗原和（ii）多肽，且L是接头，借此用星号作标记的氮原子与相邻的X的CH2基团共价结合。2.权利要求1的抗体，其进一步特征在于其不结合也在图3A中描述的式II的化合物（式II）。3.根据权利要求1或2任一项的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体对选自在图2K中描述的式IIIA（=化合物[29]）在图2L中描述的式IIIB（=化合物[30]）和在图3B中描述的式IIIC的化合物组的任意一种化合物的结合亲和力为对式II化合物的结合亲和力的至少50倍。4.根据权利要求3的单克隆抗体，其中所述单克隆抗体对选自在图2K中描述的式IIIA（=化合物[29]）、在图2L中描述的式IIIB（=化合物[30]）和在图3B中描述的式IIIC的化合物组的任意一种化合物的结合亲和力为对式II化合物的结合亲和力的至少500、至少1,000、至少5,000、至少10,000、至少50,000和至少100,000倍。5.用于测量样品中的分析物的方法，其中（链霉）抗生物素蛋白/生物素结合对用于将生物素化的分析物特异性结合剂结合到（链霉）抗生物素蛋白包被的固相上，所述方法包括向样品添加a）根据权利要求1-4任一项的抗体，b）生物素化的分析物特异性结合剂，c）（链霉）抗生物素蛋白包被的固相，后面是测量结合到固相上包被的（链霉）抗生物素蛋白和生物素化的分析物特异性结合剂的分析物。6.权利要求5的方法，其中步骤5（a）和任选的还有步骤5（b）在步骤5（c）之前进行。7.根据权利要求1-4任一项的抗体在用于测量样品中分析物的方法中的用途，其中（链霉）抗生物素蛋白/生物素对用于将生物素化的分析物特异性结合剂结合至（链霉）抗生物素蛋白包被的固相或标记的（链霉）抗生物素蛋白。8.免疫测定测试试剂盒，其至少包括a）根据权利要求1-4任一项的抗体，b）生物素化的分析物特异性结合剂，和c）（链霉）抗生物素蛋白包被...

【专利技术属性】
技术研发人员：M格尔格，D海因德尔，L希尔林豪斯，K希尔策尔，CD霍耶，F胡贝尔，HP约泽尔，T迈尔，M施雷姆尔，E福斯，
申请(专利权)人：豪夫迈·罗氏有限公司，
类型：发明
国别省市：瑞士,CH