本发明专利技术提供一种能够在CHO细胞株中高效表达的非洲猪瘟CD2V蛋白，其氨基酸序列为SEQ ID NO:4；本发明专利技术所构建的重组质粒用于在CHO细胞中表达非洲猪瘟病毒CD2V蛋白；本发明专利技术还提供一种重组CHO细胞株，是用上述的重组质粒转染CHO细胞制备的，可用于制备CD2V蛋白，所制备的蛋白可用于鉴别诊断非洲猪瘟。本发明专利技术的表达非洲猪瘟CD2V蛋白细胞株，表达量高，易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。
A CHO Cell Line Expressing CD2V Protein of African Swine Fever
【技术实现步骤摘要】
一种高效表达非洲猪瘟CD2V蛋白的CHO细胞株
本专利技术属于兽用生物制品
，具体涉及一种高效表达非洲猪瘟CD2V蛋白的CHO细胞株。
技术介绍
非洲猪瘟(AfricanSwinefever，EastAfricanSwinefever,ASF)，是一种急性，发热传染性很高的滤过性病毒所引起的猪病，其特征是发病过程短，但死亡率高达100％，临床表现为发热，皮肤发绀，淋巴结，肾，胃肠粘膜明显出血。本病自1909年在肯尼亚首次报道，一直存在于撒哈拉以南的非洲国家，1957年先后流传至西欧和拉美国家，多数被及时扑灭，但在葡萄牙，西班牙西南部和意大利的撒丁岛仍有流行。2007年以来，非洲猪瘟在全球多个国家发生、扩散、流行，特别是俄罗斯及其周边地区。2017年3月，俄罗斯远东地区伊尔库茨克州发生非洲猪瘟疫情，疫情发生地距离我国较近。2018年，经中国动物卫生与流行病学中心诊断，沈阳市沈北新区沈北街道(新城子)五五社区发生疑似非洲猪瘟疫情。非洲猪瘟的传入和疫情的出现，对我国养猪生产已构成严重威胁，高度重视非洲猪瘟的防控对于保障生猪产业的健康发展极其重要。非洲猪瘟(ASF)的病原是非洲猪瘟病毒(ASFV)，病毒主要的靶细胞是单核细胞和肺泡巨噬细胞。软蜱(钝缘蜱)是该病毒主要的传播媒介和贮藏宿主。ASFV主要以家猪/猪、家猪/软蜱/野猪、家猪/软蜱三种方式循环传播。ASFV是非洲猪瘟病毒科、非洲猪瘟病毒属的唯一成员。病毒粒子直径约为200nm，呈正20面体结构，由多层同心圆结构组成，由内到外依次是类核、核壳、内膜、衣壳和外囊膜。ASFV基因组为线性双链DNA分子，约为170～193kb。基因组的两端通过部分碱基配对形成发夹环，中间区域较为保守，两端靠近发夹环部位有末端重复序列和可变区。不同的毒株因基因组可变区长度不同而导致其基因组大小存在差异。非洲猪瘟病毒基因组编码151～167种蛋白质，成熟的病毒粒子包含54种结构蛋白；可根据p72和CD2V分别进行基因型和血清型分析。CD2V是非洲猪瘟中蛋白中仅有糖基化蛋白之一，在病毒的逃逸机制中存在重要的意义。非洲猪瘟病毒编码的CD2V蛋白与宿主的CD2蛋白相似，CD2V蛋白在T细胞和NK细胞中表达，该蛋白能使病毒感染的细胞及细胞外病毒颗粒吸附红细胞，而病毒在家猪间传播也是由于CD2V蛋白的表达，同时该蛋白损坏了淋巴细胞的功能。目前还没有针对非洲猪瘟的疫苗，如何阻断病毒在家猪中的传播，防止病毒在机体内的逃逸，样对防御非洲猪瘟具有重大意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种高效表达非洲猪瘟CD2V蛋白的CHO细胞株，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种能够在CHO细胞株中高效表达的非洲猪瘟CD2V蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:4；编码上述CD2V蛋白的基因，其核酸序列为SEQIDNO:3；本专利技术再一个方面提供一种能表达上述CD2V蛋白的重组质粒，其中包含有编码CD2V蛋白的核苷酸片段；所述的核苷酸片段的序列为SEQIDNO:3；本专利技术所构建的重组质粒用于在CHO细胞中表达非洲猪瘟病毒CD2V蛋白；本专利技术还提供一种重组CHO细胞株，是用上述的重组质粒转染CHO细胞制备的，可用于制备CD2V蛋白，所制备的蛋白可用于鉴别诊断非洲猪瘟。本专利技术的表达非洲猪瘟CD2V蛋白细胞株，表达量高，易于纯化，可用于鉴别诊断，为生产非洲猪瘟亚单位疫苗和诊断试剂奠定了坚实的基础。具体实施方式本专利技术以2018年分离的沈阳毒株CD2V蛋白出发，经剪切优化后，用CHO细胞表达系统表达了重组CD2V蛋白，该蛋白为鉴别诊断以及后期的亚单位疫苗奠定基础。下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。本专利技术所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本专利技术实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本专利技术。实施例1、表达CD2V基因的重组质粒的构建1.1CD2V基因的剪切、优化将核苷酸序列为SEQIDNO:1的CD2V基因(编码蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2)的结构域进行分析后，将蛋白的C末端150aa剪切掉，从而能够更好的帮助蛋白更好地折叠为三级结构，使其抗原位点更好地暴露出来。为了蛋白的纯化以及后期检测的方便，将C端加入6个His氨基酸。由于CD2V核苷酸序列中存在很多稀有密码子，将其核苷酸进行了密码子优化，从而能够在CHO细胞中高效表达CD2V蛋白。优化后的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3，优化修饰后的氨基酸的序列为SEQIDNO:4，能更好的表达出抗原位点。1.214.4-CD2V重组质粒的构建1.2.1酶切反应1.2.1.1标记好需要用到的1.5mLEP管，在1.5mLEP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：1.2.1.2将步骤1.2.1.1中的1.5mLEP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。1.2.2双酶切产物胶回收取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μLPCbuffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中。(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PWbuffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。(8)重复步骤(7)。(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μLElutionbuffer(65℃预热)，静置3min，离心12,000rpm，2min。(11)从离心机中取出步骤(10)中离心管，丢弃中间的吸附柱CB2，盖上离心管盖子，保留离心管中的DNA样品。(12)将步骤11中的DNA样品置于4℃保存，准备琼脂糖凝胶电泳鉴定胶回收DNA片段。1.2.3连接反应(1)标记需要用到的0.2mL离心管。(2)在标记完整的0.2mL管中按照下表的20μL反应体系进行加样：(3)完成加样后，用移液器轻轻吹打几次混匀各组分。(4)将0.2mL离心管置于37℃反应30min，待反应完成后，立即将反应管置于冰水浴中冷却5min。(5)步骤(4)的反应产物可直接进行转化实验，也可储存于-20℃，待需要时解冻转化。1.2.4转化反应(1)将10μL连接反应液快速加入100μL感受态细胞中，并吹打混匀，冰浴30min。(2)步骤(1)完成后，取出样品管，置于42℃水浴100s，然后立即冰浴2min。(3)步骤(2)完成后，取出样品管，在超净工作台中，向样品管中加本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种能够在CHO细胞株中高效表达的非洲猪瘟CD2V蛋白，其特征在于，所述的CD2V蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。
【技术特征摘要】
1.一种能够在CHO细胞株中高效表达的非洲猪瘟CD2V蛋白，其特征在于，所述的CD2V蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4。2.一种基因，其特征在于，所述的基因编码权利要求1所述的非洲猪瘟CD2V蛋白。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述基因的核酸序列为SEQIDNO:3。4.一种重组质粒，其特征在于，所述的重组质粒中包含有权利要求2所述的基因。5.权利要求4所述的重组质粒在CHO细胞中表达非洲猪瘟病毒CD2V蛋白的应用。6.一种重...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟伟，刘大卫，向银辉，王玉红，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。