一种鸡传染性贫血亚单位疫苗制造技术

本发明专利技术提供一种鸡传染性贫血病毒的VP1和VP2蛋白，其中VP1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。本发明专利技术再一个方面一种重组杆状病毒，其携带有编码上述VP1和VP2蛋白的核苷酸片段。本发明专利技术所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中表达鸡传染性贫血病毒VP1和VP2蛋白。本发明专利技术还提供一种鸡传染性贫血病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本发明专利技术制备的VP1和VP2蛋白。本发明专利技术制备的疫苗免疫蛋鸡后能提高免疫抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防鸡传染性贫血病毒的感染。

A Subunit Vaccine for Infectious Anemia in Chicken

【技术实现步骤摘要】
一种鸡传染性贫血亚单位疫苗
本专利技术属于家禽疫苗制备
，具体涉及一种鸡传染性贫血病毒亚单位疫苗。
技术介绍
鸡传染性贫血病毒是一种常见的免疫抑制病毒，可引起雏鸡胸腺萎缩、再生障碍性贫血、肌肉和皮下组织出血，所有日龄的鸡都容易感染。鸡传染性贫血病是一种全球性的重大传染病，引起免疫抑制，导致继发感染的死亡率很高，并且使其他疫苗的免疫效果也很差。该病已经在韩国、阿根廷、尼日利亚、匈牙利等国家暴发。国内的广东省、北京市、浙江省、上海市等地区的养鸡场阳性率也达到了42％。因此，迫切需要研制相应疫苗防控该病。鸡传染性贫血病毒属于圆环病毒科，无囊膜，病毒直径25～35nm，含有单股负链环状DNA基因组。基因组长2298～2319个碱基。病毒衣壳含有VP1、VP2、VP3三种病毒蛋白。VP1为主要的衣壳蛋白。VP2为辅助蛋白，辅助VP1形成正确的构象，暴露其中和性抗原位点。VP1和VP2都能诱导产生中和性抗体。VP3是非结构蛋白，称为凋亡蛋白。杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)。AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Andersonetal.,1995；Wangetal.,2001；Ribeiroetal.，2001)。目前，鸡传染性贫血病疫苗主要是灭活苗和弱毒活疫苗。因为鸡传染性贫血病毒可以引起免疫抑制，所以灭活苗免疫效果不理想。而弱毒活疫苗有残存毒力，并且有毒力返强的可能性，安全性受质疑。所以需要研究亚单位疫苗。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种鸡传染性贫血病毒亚单位疫苗及其制备方法，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种鸡传染性贫血病毒的VP1和VP2蛋白，其中VP1蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:5；VP2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4；编码上述VP1蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:6；编码VP2蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:7；本专利技术再一个方面一种重组杆状病毒，其携带有编码上述VP1和VP2蛋白的核苷酸片段；本专利技术所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中表达鸡传染性贫血病毒VP1和VP2蛋白；本专利技术所制备的蛋白用于制备疫苗；本专利技术还提供一种鸡传染性贫血病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本专利技术制备的VP1和VP2蛋白。本专利技术制备的疫苗免疫蛋鸡后能提高免疫抗体水平，保证其子代母源抗体水平，预防鸡传染性贫血病毒的感染。具体实施方式本专利技术通过对筛选获得的、发生遗传变异的鸡传染性贫血病毒的VP1和VP2的cDNA全序列进行分析，选取了其中一段抗原表位较丰富的VP1和VP2的cDNA序列。对VP1和VP2蛋白进行改造，使VP1和VP2的编码基因能够在昆虫细胞中高效表达，从而能够利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备蛋白，病毒蛋白产量显著高于鸡胚培养的病毒，生产成本明显降低。下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。本专利技术所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本专利技术实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本专利技术。实施例1、鸡传染性贫血VP1、VP2蛋白的筛选2016年山东省某鸡场的鸡群中出现了典型的鸡传染性贫血病症状。为了分离病原，无菌采集发病鸡的胸腺，用无菌生理盐水匀浆制成悬液，离心取上清除菌后经尿囊腔分别接种6.5日龄SPF胚，孵化264小时，收集胚体组织，经匀浆后，反复冻融后，取上清液冻存。收获的病毒液经纯化后进行了病毒含量、免疫原性、特异性及纯净性等方面的病毒特性的分析检测，结果表明分离的毒株与鸡传染性贫血发生特异性反应，无细菌、支原体及外源病毒污染。对于本专利技术筛选的毒株的性状进行检测，结果表明，该株病毒属鸡传染性贫血病毒，攻毒实验结果表明筛选的该病毒可引起雏鸡发生死亡。对该毒株的结构蛋白基因VP1和VP2进行了测序，VP1基因全长1350bp，编码450个氨基酸，其氨基酸序列为SEQIDNO:2，编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:1；VP2基因全长651bp，编码217个氨基酸，其氨基酸序列为SEQIDNO:4，编码基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3。将其与GenBank中收录的VP1、VP2基因序列进行同源性分析，发现本专利技术获得毒株的VP1氨基酸的第64位(P变D)、第138位(S变R)、第142位(A变T)、第149位(C变E)、第165位(W变G)、第217位(N变H)、第294位(Q变S)、第367位(S变K)，同源性分析约97.5～98.7％；VP2氨基酸的第14位(E变D)、第33位(V变G)、第87位(C变W)、第124位(I变T)，同源性分析约95.8～98.1％。结果表明筛选病毒的VP1、VP2蛋白与已报道的鸡传染性贫血病毒的VP1、VP2基因存在着氨基酸差异。实施例2、表达VP1、VP2基因的重组杆状病毒的构建2.1VP1、VP2基因的剪切、优化将VP1基因N端32aa剪切掉，把C端7aa剪切掉，将保守序列的第173位M突变为P，第304位W突变为S，从而帮助蛋白更好地折叠为三级结构，将其抗原位点更好地暴露出来，将N端加上起始密码子；优化修饰后的氨基酸的序列为SEQIDNO:5，能很好地表达出抗原位点；同时将密码子进行优化为了更好地表达；优化后的VP1基因的核苷酸序列为SEQIDNO:6。将VP2基因进行了密码子优化，优化后的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:7。2.2VP1阳性质粒的构建2.2.1酶切反应2.2.1.1标记好需要用到的1.5mLEP管，在1.5mLEP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：2.2.1.2将步骤2.2.1.1中的1.5mLEP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。2.2.2双酶切产物胶回收取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μLPCbuffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种鸡传染性贫血病毒的VP1和VP2蛋白，其特征在于，所述的VP1蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:5；VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:4。

【技术特征摘要】
1.一种鸡传染性贫血病毒的VP1和VP2蛋白，其特征在于，所述的VP1蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:5；VP2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4。2.一种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1所述的VP1和VP2蛋白。3.如权利要求2所述的基因，其特征在于，所述的基因，其中编码VP1蛋白的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:6；编码VP2蛋白的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:7。4.一种重组杆状病毒，其特征在于，所述的重组杆状病毒携带有编码权利要求1所述的VP1和VP2蛋白的核苷酸片段。5.如权利要求4所述的重组杆状病毒，其特征在于，所述的核苷酸片段，其中编码VP1蛋白的基因的核...

【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟伟，向银辉，刘大卫，陈俭梅，赵鹏，韩乃君，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37