一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及兽病检测技术领域，且公开了一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，具体制备方法包括以下步骤：S1、重组ORF2蛋白的表达：将pET‑28a‑ORF2转换大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆，接种于含有卡那霉素的LB培养基中，培养过夜，次日取50uL菌液接种于5mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD600值为0.6‑0.8，加入终浓度为1mM的IPTG,诱导8h后取样，同时诱导菌种pET‑28a‑BL21作为阴性对照，SDS‑PAGE凝胶电泳鉴定蛋白表达情况；S2、重组ORF2蛋白的可溶性分析：取2uL重组菌种pET‑28a‑ORF2‑BL21加入2mL含有卡那霉素LB培养基中。该猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，能够较为有效的的提高生产效率，还能够提高检测试剂对圆环病毒2型病毒检测的准确性。

【技术实现步骤摘要】
一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法
本专利技术涉及兽病检测
，具体为一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法。
技术介绍
猪圆环病毒2型在分类学上属圆环病毒科圆环病毒属，为已知的最小的动物病毒之一，对外界理化因子的抵抗力相当强，即便在PH3的酸性环境及72℃的高温环境中也能存活一段时间，氯仿作用不失活，无血凝活性。猪圆环病毒2型为致病性的病毒，猪对猪圆环病毒2型具有较强的易感性，感染猪可自鼻液、粪便等废物中排出病毒，经口腔、呼吸道途径感染不同年龄的猪。所以为了预防猪圆环病毒2型大面积传染，需要使用猪圆环病毒2型检测试剂对猪进行检测。现有的猪圆环病毒2型检测试剂制备方法在制备的过程中步骤较为繁琐，批量生产时，生产时间较长，导致猪圆环病毒2型检测试剂的生产效率降低。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，具备可以提高圆环形病毒2型检测试剂生产效率等优点，解决了现在市面上的圆环形病毒2型检测试剂生产效率较低的问题。(二)技术方案为实现上述以提高圆环形病毒2型检测试剂生产效率的目的，本专利技术提供如下技术方案：一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，具体制备方法包括以下步骤：S1、重组ORF2蛋白的表达：将pET-28a-ORF2转换大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆，接种于含有卡那霉素的LB培养基中，培养过夜，次日取50uL菌液接种于5mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG,诱导8h后取样，同时诱导菌种pET-28a-BL21作为阴性对照，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白表达情况；S2、重组ORF2蛋白的可溶性分析：取2uL重组菌种pET-28a-ORF2-BL21加入2mL含有卡那霉素LB培养基中，培养过夜，次日取1mL菌液接种于100mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD600值为0.6-0.8，加入IPTG后分别于25℃、30℃和37℃诱导蛋白表达，诱导后，12000rpm离心20min收集菌体，用裂解缓冲液重悬，于冰水浴中超声破碎，将破碎后的产物12000rpm离心20min，沉淀用PBS重悬，分别取上清和沉淀做SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定蛋白可溶性；S3、重组ORF2蛋白的纯化：使用镍柱亲和层析对可溶性的ORF2蛋白进行纯化，设置流速为1mL/min,使蛋白与层析柱充分结合，分别用250mM,500mM的咪唑洗脱目的蛋白，将收集到的蛋白液用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其组分，洗脱得到的ORF2蛋白立即放人PBS缓冲液中,透析72h,取20μL纯化过的蛋白样品,进行SDS-PAGE凝胶电泳染色前,进行Westemnblot分析,其中一抗选用PCV2阳性血清；S4、纯化后得到检测试剂血清，对生产的检测试剂血清进行抽样检查，鉴定是否对圆环病毒2型有效。优选的，所述超声破碎条件为：产生3秒，停三秒，超声时间为20min。优选的，所述卡那霉素的浓度为30mg/mL。优选的，所述LB培养基的培养温度为37℃。优选的，洗脱得到的ORF2蛋白立即放人PBS缓冲液中透析72h，期间4h更换一次PBS缓冲液。优选的，所述检测试剂需要对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒进行检测，分析检测试剂是否与这些病毒的抗体产生交叉反应。(三)有益效果与现有技术相比，本专利技术提供了一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，具备以下有益效果：1、该猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，通过简化圆环病毒2型检测试剂的合成步骤，减少圆环病毒2型检测试剂的生产流程，较好的降低了制备圆环病毒2型检测试剂所需的时间，批量生产时，降低生产时间成本，能够较为有效的提高生产效率。2、该猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，通过对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒等病毒进行对比检测，能够有效的检测到检测试剂是否与上述的病毒抗体产生交叉反应，提高检测试剂对圆环病毒2型病毒检测的准确性。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，具体制备方法包括以下步骤：S1、重组ORF2蛋白的表达：将pET-28a-ORF2转换大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆，接种于含有卡那霉素的LB培养基中，培养过夜，次日取50uL菌液接种于5mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG,诱导8h后取样，同时诱导菌种pET-28a-BL21作为阴性对照，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白表达情况；S2、重组ORF2蛋白的可溶性分析：取2uL重组菌种pET-28a-ORF2-BL21加入2mL含有卡那霉素LB培养基中，培养过夜，次日取1mL菌液接种于100mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD600值为0.6-0.8，加入IPTG后分别于25℃、30℃和37℃诱导蛋白表达，诱导后，12000rpm离心20min收集菌体，用裂解缓冲液重悬，于冰水浴中超声破碎，将破碎后的产物12000rpm离心20min，沉淀用PBS重悬，分别取上清和沉淀做SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定蛋白可溶性；S3、重组ORF2蛋白的纯化：使用镍柱亲和层析对可溶性的ORF2蛋白进行纯化，设置流速为1mL/min,使蛋白与层析柱充分结合，分别用250mM,500mM的咪唑洗脱目的蛋白，将收集到的蛋白液用SDS-PAGE凝胶电泳鉴定其组分，洗脱得到的ORF2蛋白立即放人PBS缓冲液中,透析72h,取20μL纯化过的蛋白样品,进行SDS-PAGE凝胶电泳染色前,进行Westemnblot分析,其中一抗选用PCV2阳性血清；S4、纯化后得到检测试剂血清，对生产的检测试剂血清进行抽样检查，鉴定是否对圆环病毒2型有效。超声破碎条件为：产生3秒，停三秒，超声时间为20min。卡那霉素的浓度为30mg/mL。LB培养基的培养温度为37℃。洗脱得到的ORF2蛋白立即放人PBS缓冲液中透析72h，期间4h更换一次PBS缓冲液。检测试剂需要对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒进行检测，分析检测试剂是否与这些病毒的抗体产生交叉反应。综上所述，该猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，通过简化圆环病毒2型检测试剂的合成步骤，减少圆环病毒2型检测试剂的生产流程，较好的降低了制备圆环病毒2型检测试剂所需的时间，批量生产时，降低生产时间成本，能够较为有效的提高生产效率，通过对猪瘟病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒和猪伪狂犬病毒等病毒进行对比检测，能够有效的检测到检测试剂是否与上述的病毒抗体产生交叉反应，提高检测试剂对圆环病毒2型病毒检测的准确性。需要说明的是，术语“包括”，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，其特征在于，具体制备方法包括以下步骤：S1、重组ORF2蛋白的表达：将pET‑28a‑ORF2转换大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆，接种于含有卡那霉素的LB培养基中，培养过夜，次日取50uL菌液接种于5mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD600值为0.6‑0.8，加入终浓度为1mM的IPTG,诱导8h后取样，同时诱导菌种pET‑28a‑BL21作为阴性对照，SDS‑PAGE凝胶电泳鉴定蛋白表达情况；S2、重组ORF2蛋白的可溶性分析：取2uL重组菌种pET‑28a‑ORF2‑BL21加入2mL含有卡那霉素LB培养基中，培养过夜，次日取1mL菌液接种于100mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD600值为0.6‑0.8，加入IPTG后分别于25℃、30℃和37℃诱导蛋白表达，诱导后，12000rpm离心20min收集菌体，用裂解缓冲液重悬，于冰水浴中超声破碎，将破碎后的产物12000rpm离心20min，沉淀用PBS重悬，分别取上清和沉淀做SDS‑PAGE凝胶电泳，鉴定蛋白可溶性；S3、重组ORF2蛋白的纯化：使用镍柱亲和层析对可溶性的ORF2蛋白进行纯化，设置流速为1mL/min,使蛋白与层析柱充分结合，分别用250mM,500mM的咪唑洗脱目的蛋白，将收集到的蛋白液用SDS‑PAGE凝胶电泳鉴定其组分，洗脱得到的ORF2蛋白立即放人PBS缓冲液中,透析72h,取20μL纯化过的蛋白样品,进行SDS‑PAGE凝胶电泳染色前,进行Westemn blot分析,其中一抗选用PCV2阳性血清；S4、纯化后得到检测试剂血清，对生产的检测试剂血清进行抽样检查，鉴定是否对圆环病毒2型有效。...

【技术特征摘要】
1.一种猪用圆环病毒2型检测试剂的制备方法，其特征在于，具体制备方法包括以下步骤：S1、重组ORF2蛋白的表达：将pET-28a-ORF2转换大肠杆菌BL21感受态细胞，挑取阳性克隆，接种于含有卡那霉素的LB培养基中，培养过夜，次日取50uL菌液接种于5mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD600值为0.6-0.8，加入终浓度为1mM的IPTG,诱导8h后取样，同时诱导菌种pET-28a-BL21作为阴性对照，SDS-PAGE凝胶电泳鉴定蛋白表达情况；S2、重组ORF2蛋白的可溶性分析：取2uL重组菌种pET-28a-ORF2-BL21加入2mL含有卡那霉素LB培养基中，培养过夜，次日取1mL菌液接种于100mL含有卡那霉素的LB培养基中，培养2h至OD600值为0.6-0.8，加入IPTG后分别于25℃、30℃和37℃诱导蛋白表达，诱导后，12000rpm离心20min收集菌体，用裂解缓冲液重悬，于冰水浴中超声破碎，将破碎后的产物12000rpm离心20min，沉淀用PBS重悬，分别取上清和沉淀做SDS-PAGE凝胶电泳，鉴定蛋白可溶性；S3、重组ORF2蛋白的纯化：使用镍柱亲和层析对可溶性的ORF2蛋白进行纯化，设置流速为1mL/min,使蛋白与层析柱充分结合，分别用2...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志宏，
申请(专利权)人：广州昭越生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44