一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法技术

本发明专利技术涉及检测试剂技术领域，且公开了一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，包括如下步骤：步骤一：提炼目的基因；步骤二：制备互补脱氧核糖核酸；步骤三：进行不对称的PCR扩增。该能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，具备能快速定性检测猪瘟病毒的优点。

Preparation of a rapid and qualitative detection reagent for classical swine fever virus*

The invention relates to the technical field of detection reagents, and discloses a preparation method of detection reagents capable of rapid qualitative detection of classical swine fever virus, including the following steps: step 1: extracting target genes; step 2: preparing complementary deoxyribonucleic acid; step 3: carrying out asymmetric PCR amplification. The preparation method of the detection reagent which can quickly and qualitatively detect classical swine fever virus has the advantages of rapid and qualitative detection of classical swine fever virus.

【技术实现步骤摘要】
一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法
本专利技术涉及检测试剂
，具体为一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法。
技术介绍
猪瘟俗称“烂肠瘟”，是由黄病毒科猪瘟病毒属的猪瘟病毒引起的一种急性、发热、接触性传染传染病。具有高度传染性和致死性。本病在自然条件下只感染猪，不同年龄、性别、品种的猪和野猪都易感，一年四季均可发生。是猪的一种急性接触性传染病，又称猪霍乱。1885年首先在美国发现，以后传播到世界各大洲。中国大部分省都有发生。1903年美国兽医学家德希尼兹和多赛特鉴定本病的病原是披盖病毒科的瘟病毒属中的猪瘟病毒。主要通过直接接触，或由于接触污染的媒介物而发病。消化道、鼻腔粘膜和破裂的皮肤均是感染途径。一年四季都可发生，以春夏多雨季节为多，人工接种的猪，一般在36～48小时后体温升高。而自然感染的潜伏期常为3～6天，间有延长到24天的。典型病例表现为最急性、亚急性或慢性病程，死亡率高。最急性型较少见，病猪体温升高，常无其他症状，1～2天内死亡。急性型最常见，体温可上升到41℃以上，食欲减退或消失，可发生眼结膜炎并有脓性分泌物，鼻腔也常流出脓性粘液，间有呕吐，有时排泄物中带血液，甚至便血。初期耳根、腹部、股内侧的皮肤常有许多点状出血或较大红点。病程一般为1～2周，最后绝大多数死亡。亚急性型常见于本病流行地区，病程可延至2～3周；有的转为慢性，常拖延1～2个月。表现粘膜苍白，眼睑有出血点。皮肤出现紫斑，病猪极度消瘦。死亡以仔猪为多，成年猪有的可以耐过。非典型病猪临诊症状不明显，呈慢性，常见于“架子猪”。剖检时急性型以出血性病变为主，常见肾皮质和膀胱粘膜中有小点出血；肠系膜淋巴结肿胀，常出现出血性肠炎，以大肠粘膜中的钮扣状溃疡为典型。传统的猪瘟检测方法主要包括：电泳检测技术、荧光技术、结合试验技术、核酸杂交、凝胶电泳等，这些方法在病毒病诊断和进出口检验检疫中起了重要作用，但普遍存在着明显的不足，诸如检测时间长，实验过程复杂，在进行大批量检测时工作效率低，给猪瘟的检测带来巨大困难。
技术实现思路
(一)解决的技术问题针对现有技术的不足，本专利技术提供了一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，具备能快速定性检测猪瘟病毒的优点，解决了现在市面的检测试剂检测时间长，实验过程复杂，在进行大批量检测时工作效率低，给猪瘟的检测带来巨大困难的问题。(二)技术方案为实现能快速定性检测猪瘟病毒的目的，本专利技术提供如下技术方案：一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，包括如下步骤：步骤一：提炼目的基因S1.准备一头得了猪瘟的生猪，提炼生猪体内的PK-15细胞；S2.将S1中得到的PK-15细胞放置在冷冻室内以零下70°的温度进行冻融12-26分钟，重复三次；S3.提取120μlPK-15细胞和800μl的RNA裂解液放置在同一个搅拌罐内进行搅拌均匀，并且静置8-12分钟；S4.在S3中拌匀的搅拌液中添加150μl的三氯甲烷，将其放入离心搅拌罐中以8500g/min的速度离心搅拌7-13分钟；S5.提取S4中得到液体的上层部分，并将其放置在一个干净的试管内，并添加350μl的二甲基甲醇，静置沉淀5-8min后再放入离心搅拌罐中以8500g/min的速率离心搅拌5min；S6.将S5中提取的液体放置在正常室温环境下自然晾干，再添加15μlDEPC处理过的水得到目标基因RNA；步骤二：制备互补脱氧核糖核酸S1.提取8μl步骤一中所得到的目标基因RNA；S2.在其中添加3μl的反向引物和2μl的三磷酸碱基脱氧核苷酸，在45°的温度下养育3min，再快速冷却2min得到互补脱氧核糖核酸；步骤三：进行不对称的PCR扩增S1.提取3μl步骤二中得到的互补脱氧核糖核酸；S2.将S1中得到的互补脱氧核糖核酸加入到80μl的不对称PCR体系中进行充分反应，先在95°的温度下预变性3min；92°的温度下变性20s，53°的温度下退火10s，70°的温度下延伸12s，重复扩增30-60次；S4.将S2中重复扩增的产物在70°的温度下延伸8min；S5.得到最终检测试剂。优选的，所述步骤二中的反向引物的序列是5'-GCCGATTGGTCAGGATCAAAACTTATAAAAAGCATAT-3'。优选的，所述步骤三中80μl不对称PCR体系的组成为：含染料2×TaqMasterMix10μL，灭菌去离子水(ddH2O)7.7μL，正向引物和反向引物各0.15μL，DNA模板2μL，MgCl2溶液8μl(2.5mmol/L)，三磷酸碱基脱氧核苷酸溶液2μl(10mmol/L)以及余量的无菌双蒸水。(三)有益效果与现有技术相比，本专利技术提供了一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，具备以下有益效果：该能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，通过分别取G4DNA酶显色反应缓冲液、上游探针和下游探针，再添加无菌双蒸水，最后加入检测试剂，静置等待显色观察中，观察是否颜色有变化，在有对应脱氧核糖核酸的条件下，探针与模板进行相关的特异性结合，两基团相互靠近形成G4DNA过氧化物酶，处于显色条件下的反应物质即可反应显示绿色光亮，直接观察是否出现颜色变化即可快速的得知对象是否带有猪瘟病毒，呈现绿色为阳性，不变色则为阴性，通过选择不对称PCR反应体系，利用浓度有明显差异的特异性上、下游引物进行不对称PCR扩增；不对称PCR进行完成后，可以直接进行下一步的显色反应，从而实现了检测的方便、快捷。具体实施方式下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本专利技术一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本专利技术中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本专利技术保护的范围。一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，包括如下步骤：步骤一：提炼目的基因S1.准备一头得了猪瘟的生猪，提炼生猪体内的PK-15细胞；S2.将S1中得到的PK-15细胞放置在冷冻室内以零下70°的温度进行冻融12-26分钟，重复三次；S3.提取120μlPK-15细胞和800μl的RNA裂解液放置在同一个搅拌罐内进行搅拌均匀，并且静置8-12分钟；S4.在S3中拌匀的搅拌液中添加150μl的三氯甲烷，将其放入离心搅拌罐中以8500g/min的速度离心搅拌7-13分钟；S5.提取S4中得到液体的上层部分，并将其放置在一个干净的试管内，并添加350μl的二甲基甲醇，静置沉淀5-8min后再放入离心搅拌罐中以8500g/min的速率离心搅拌5min；S6.将S5中提取的液体放置在正常室温环境下自然晾干，再添加15μlDEPC处理过的水得到目标基因RNA；步骤二：制备互补脱氧核糖核酸S1.提取8μl步骤一中所得到的目标基因RNA；S2.在其中添加3μl的反向引物和2μl的三磷酸碱基脱氧核苷酸，在45°的温度下养育3min，再快速冷却2min得到互补脱氧核糖核酸；步骤三：进行不对称的PCR扩增S1.提取3μl步骤二中得到的互补脱氧核糖核酸；S2.将S1中得到的互补脱氧核糖核酸加入到80μl的不对称PCR体系中进行充分反应，先在95°的温度下预变性3min；92°的温度下变性20s，53°的温度下退火1本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：提炼目的基因S1.准备一头得了猪瘟的生猪，提炼生猪体内的PK‑15细胞；S2.将S1中得到的PK‑15细胞放置在冷冻室内以零下70°的温度进行冻融12‑26分钟，重复三次；S3.提取120μlPK‑15细胞和800μl的RNA裂解液放置在同一个搅拌罐内进行搅拌均匀，并且静置8‑12分钟；S4.在S3中拌匀的搅拌液中添加150μl的三氯甲烷，将其放入离心搅拌罐中以8500g/min的速度离心搅拌7‑13分钟；S5.提取S4中得到液体的上层部分，并将其放置在一个干净的试管内，并添加350μl的二甲基甲醇，静置沉淀5‑8min后再放入离心搅拌罐中以8500g/min的速率离心搅拌5min；S6.将S5中提取的液体放置在正常室温环境下自然晾干，再添加15μlDEPC处理过的水得到目标基因RNA；步骤二：制备互补脱氧核糖核酸S1.提取8μl步骤一中所得到的目标基因RNA；S2.在其中添加3μl的反向引物和2μl的三磷酸碱基脱氧核苷酸，在45°的温度下养育3min，再快速冷却2min得到互补脱氧核糖核酸；步骤三：进行不对称的PCR扩增S1.提取3μl步骤二中得到的互补脱氧核糖核酸；S2.将S1中得到的互补脱氧核糖核酸加入到80μl的不对称PCR体系中进行充分反应，先在95°的温度下预变性3min；92°的温度下变性20s，53°的温度下退火10s，70°的温度下延伸12s，重复扩增30‑60次；S4.将S2中重复扩增的产物在70°的温度下延伸8min；S5.得到最终检测试剂。...

【技术特征摘要】
1.一种能快速定性检测猪瘟病毒的检测试剂的制备方法，其特征在于：包括如下步骤：步骤一：提炼目的基因S1.准备一头得了猪瘟的生猪，提炼生猪体内的PK-15细胞；S2.将S1中得到的PK-15细胞放置在冷冻室内以零下70°的温度进行冻融12-26分钟，重复三次；S3.提取120μlPK-15细胞和800μl的RNA裂解液放置在同一个搅拌罐内进行搅拌均匀，并且静置8-12分钟；S4.在S3中拌匀的搅拌液中添加150μl的三氯甲烷，将其放入离心搅拌罐中以8500g/min的速度离心搅拌7-13分钟；S5.提取S4中得到液体的上层部分，并将其放置在一个干净的试管内，并添加350μl的二甲基甲醇，静置沉淀5-8min后再放入离心搅拌罐中以8500g/min的速率离心搅拌5min；S6.将S5中提取的液体放置在正常室温环境下自然晾干，再添加15μlDEPC处理过的水得到目标基因RNA；步骤二：制备互补脱氧核糖核酸S1.提取8μl步骤一中所得到的目标基因RNA；S2.在其中添加3μl的反向引物和2μl的三磷酸碱基脱氧核苷酸，在45°的温度下养育3min，再快速冷却2min得到互...

【专利技术属性】
技术研发人员：王志宏，
申请(专利权)人：广州昭越生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44