特异检测猪流感病毒的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及特异检测猪流感病毒的RT‑LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。该RT‑LAMP检测引物选自如下引物组中一组或几组：(1)引物组SIV1；(2)引物组SIV2；(3)引物组SIV3。本发明专利技术提供的RT‑LAMP引物组可精确检测猪流感病毒，与猪蓝耳病毒美洲型高致病株，美洲型经典株、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒等无交叉。本发明专利技术筛选到的3套引物覆盖了NCBI数据库中3000多条猪流感病毒序列，检测灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，不需中途开盖，避免污染。

RT-LAMP detection primer for specific detection of swine influenza virus and its application, detection reagent and method

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to RT LAMP detection primers for specific detection of swine influenza virus and its application, detection agents and methods. The RT LAMP detection primers were selected from one or more of the following primer groups: (1) primer group SIV1; (2) primer group SIV2; (3) primer group SIV3. The RT LAMP primer group provided by the invention can accurately detect swine influenza virus, and has no cross with porcine blue ear virus American highly pathogenic strain, classical American strain, porcine parvovirus, porcine circovirus type 2, classical swine fever virus and pseudorabies virus. The 3 sets of primers screened by the invention cover more than 3000 swine influenza virus sequences in the NCBI database, and the detection sensitivity is high and the specificity is strong. The established detection method has the advantages of high accuracy, short detection time and real-time observation of the results, and only needs 1H from sample processing to the report results.

【技术实现步骤摘要】
特异检测猪流感病毒的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及特异检测猪流感病毒的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。
技术介绍
猪流感(swineinfluenza，SI)是由猪流感病毒(swineinfluenzavirus，SIV)引起的一种急性、高度接触传染性的群发性呼吸道疾病。以发病突然、传播迅速、康复快、死亡率低为特征，是集约化、规模化猪场常见的季节性疾病，给养猪业造成了严重的经济损失。此外，由于猪的呼吸道上皮细胞同时具有识别和结合人流感病毒与禽流感病毒的唾液酸受体，被证实是人和禽流感病毒重要的中间宿主，发挥着基因“混合器”的作用。多种流感病毒的共感染，使猪体内的流感病毒不断发生基因重组和进化变异，而新产生的变异病毒可能具有危害公共卫生安全的潜在风险。另一方面，猪流感病毒可以突破种间屏障，直接由猪传播至人，部分病毒株还可在人际间有效传播。因此，有必要开发出一种猪SIV的定性、定量快速检测方法用于猪流感(SI)的防控。检测猪流感病毒常用的方法有：病毒分离、血凝(HA)及血凝抑制(HI)试验、酶联免疫吸附试验(ELISA)、免疫组织化学(IHC)等。但这些方法操作繁琐费时，随着分子诊断技术的发展，出现了新的快速的诊断方法：1)反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)，该方法灵敏度不够高，可能造成漏检，且不能实现对病毒的定量检测；2)TaqMan探针方法，该方法可以弥补RT-PCR的缺点，但是探针的价格较普通引物昂贵，且病毒变异度高，不同的株系需要不同的探针，覆盖度很难保证；3)反转录-环介导等温扩增法(Reversetranscriptionloop-mediatedisothermalamplification，RT-LAMP)，目前已有应用LAMP检测猪流感病毒的专利，但是该专利利用沉淀法或者显色法判定实验结果。离心观察有无沉淀，因肉眼分辨率有限，微量沉淀很难判定，灵敏度不够。显色法灵敏度会有所提升，但是开盖加染料，特别容易造成污染，出现假阳性。此外，也有利用基因芯片来检测A型流感病毒(申请号201610906754.2A型流感病毒检测基因芯片)。该专利对H1N1、H3N2、H5N1、H9N2四种亚型进行检测和分型的79条特异性寡核苷酸探针、两条质控探针和载体，对四个亚型都设计了多对探针，覆盖面广。但是此方法需要先RT-PCR，然后荧光标记，杂交。操作繁琐，耗时较长，成本也很高。逆转录-环介导等温扩增技术(ReverseTranscriptionLoop-MediatedIsothermalAmplification,RT-LAMP)是一种新颖的RNA扩增方法。其基本原理是采用4到6条特异引物(针对基因的6到8个区域)及一种具有链置换活性的DNA聚合酶和AMV反转录酶，在60～65℃左右对RNA进行同步反转录及等温扩增，短时间扩增效率可达到109～1010个拷贝。RT-LAMP具有高特异性、高效性、快速、简便、易检测等特点。目前仅有一个利用环介导等温扩增(LAMP)技术检测猪流感病毒的专利被授权，该专利(猪流感病毒RT-LAMP检测试剂盒及其检测方法)在反应结束后的体系中加入显色剂通过观察颜色变化的方法来检测扩增产物，但此过程必须开盖添加染料，极其容易污染环境，而且肉眼分辨率有限对弱阳性的判断不够准确；此外该专利在引物设计上收集了54条GeneBank公布的猪流感病毒序列，并且随着病毒的变异引物覆盖度较窄，难以达到广谱检测的目的。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了特异检测猪流感病毒的RT-LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。该引物组可精确检测猪流感病毒，与猪蓝耳病毒美洲型高致病株，美洲型经典株、猪细小病毒、猪圆环病毒2型、猪瘟病毒、猪伪狂犬病毒等无交叉；且覆盖了NCBI数据库中3000多条猪流感病毒序列，检测灵敏度高、特异性强，准确率高，检测时间短，结果可实时观测。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了RT-LAMP检测引物，选自如下引物组中一组或几组：(1)引物组SIV1：外引物SIV1-F3：序列如SEQIDNO：1所示；外引物SIV1-B3：序列如SEQIDNO：2所示；内引物SIV1-FIP：序列如SEQIDNO：3所示；内引物SIV1-BIP：序列如SEQIDNO：4所示；(2)引物组SIV2：外引物SIV2-F3：序列如SEQIDNO：5所示；外引物SIV2-B3：序列如SEQIDNO：6所示；内引物SIV2-FIP：序列如SEQIDNO：7所示；内引物SIV2-BIP：序列如SEQIDNO：8所示；环引物SIV2-LF：序列如SEQIDNO：9所示；环引物SIV2-LB：序列如SEQIDNO：10所示；(3)引物组SIV3：外引物SIV3-F3：序列如SEQIDNO：11所示；外引物SIV3-B3：序列如SEQIDNO：12所示；内引物SIV3-FIP：序列如SEQIDNO：13所示；内引物SIV3-BIP：序列如SEQIDNO：14所示；环引物SIV3-LF：序列如SEQIDNO：15所示；环引物SIV3-LB：序列如SEQIDNO：16所示。本专利技术利用RT-LAMP实验结合荧光定量，实现实时监控反应全过程，1小时之内即可出结果。该方法既保留LAMP的简便、快速、灵敏、特异的优势，又避免了人为判定引起的误差以及显色法的假阳性。众所周知，LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。查阅文献发现通常选择编码流感病毒核蛋白的NP基因作为检测基因，将目前已报道的猪流感病毒NP基因序列进行比对和进化树分析，发现序列间差异较大，很难用一套引物来覆盖检测所有的病毒序列，因此本专利技术针对目前最流行的几个猪流感病毒亚型，以编码流感病毒核蛋白的NP基因的保守区段作为靶基因，通过人工设计了多套LAMP引物。经过初筛、复筛，最终确定了3套引物。这3套引物组合在一起检测，覆盖了NCBI数据库中3000多条猪流感病毒序列，即全世界最流行的H1N1、H1N2、H3N2亚型。就覆盖度而言，较之前的检测SIV的LAMP专利有大幅度的提升。而且灵敏度可以达到100拷贝/μL，特异性也非常好，不与猪瘟病毒(CSFV)、猪蓝耳美洲型高致病株(HP-PRRSV)、猪蓝耳美洲型经典株(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)和伪狂犬病病毒(PRV)发生交叉反应。本专利技术还提供了该RT-LAMP检测引物在制备猪流感病毒检测试剂中的应用。本专利技术还提供了一种猪流感病毒检测试剂，包括上述RT-LAMP检测引物中一组或几组。作为优选，该猪流感病毒检测试剂还包括反应缓冲液、模板DNA、AMV逆转录酶、不含RNA酶的水。作为优选，猪流感病毒检测试剂的反应体系为：外引物：各0.10～0.15μL；内引物：各0.9～1.0μL；环引物：各0.35～0.45μL；反应缓冲液：10μL；模板DNA：2μL；AMV逆转录酶：0.5μL；不含RNA酶的水：补足至20μL。优选地，猪流感病毒检测试剂的反应体系为：外引物：各0.12μL；内引物：各0.96μL；环引物：各0.4μL；反应缓冲液：10μL；模板DNA：2μL；AMV逆本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.RT‑LAMP检测引物，其特征在于，选自如下引物组中一组或几组：(1)引物组SIV1：外引物SIV1‑F3：序列如SEQ ID NO：1所示；外引物SIV1‑B3：序列如SEQ ID NO：2所示；内引物SIV1‑FIP：序列如SEQ ID NO：3所示；内引物SIV1‑BIP：序列如SEQ ID NO：4所示；(2)引物组SIV2：外引物SIV2‑F3：序列如SEQ ID NO：5所示；外引物SIV2‑B3：序列如SEQ ID NO：6所示；内引物SIV2‑FIP：序列如SEQ ID NO：7所示；内引物SIV2‑BIP：序列如SEQ ID NO：8所示；环引物SIV2‑LF：序列如SEQ ID NO：9所示；环引物SIV2‑LB：序列如SEQ ID NO：10所示；(3)引物组SIV3：外引物SIV3‑F3：序列如SEQ ID NO：11所示；外引物SIV3‑B3：序列如SEQ ID NO：12所示；内引物SIV3‑FIP：序列如SEQ ID NO：13所示；内引物SIV3‑BIP：序列如SEQ ID NO：14所示；环引物SIV3‑LF：序列如SEQ ID NO：15所示；环引物SIV3‑LB：序列如SEQ ID NO：16所示。...

【技术特征摘要】
1.RT-LAMP检测引物，其特征在于，选自如下引物组中一组或几组：(1)引物组SIV1：外引物SIV1-F3：序列如SEQIDNO：1所示；外引物SIV1-B3：序列如SEQIDNO：2所示；内引物SIV1-FIP：序列如SEQIDNO：3所示；内引物SIV1-BIP：序列如SEQIDNO：4所示；(2)引物组SIV2：外引物SIV2-F3：序列如SEQIDNO：5所示；外引物SIV2-B3：序列如SEQIDNO：6所示；内引物SIV2-FIP：序列如SEQIDNO：7所示；内引物SIV2-BIP：序列如SEQIDNO：8所示；环引物SIV2-LF：序列如SEQIDNO：9所示；环引物SIV2-LB：序列如SEQIDNO：10所示；(3)引物组SIV3：外引物SIV3-F3：序列如SEQIDNO：11所示；外引物SIV3-B3：序列如SEQIDNO：12所示；内引物SIV3-FIP：序列如SEQIDNO：13所示；内引物SIV3-BIP：序列如SEQIDNO：14所示；环引物SIV3-LF：序列如SEQIDNO：15所示；环引物SIV3-LB：序列如SEQIDNO：16所示。2.如权利要求1所述RT-LAMP检测引物在制备猪流感病毒检测试剂中的应用。3.一种猪流感病毒检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述RT-LAMP检测引物中一组或几组。4.根据权利要求3所述的猪流感病毒检测试剂，其特征在于，...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，马银平，陈燕旌，邢婉丽，程京，边素莹，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11