特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法技术

本发明专利技术涉及生物技术领域，特别涉及特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。该LAMP检测引物的序列如SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：6所示。本发明专利技术引物组可精确检测猪伪狂犬病毒野毒，与猪伪狂犬病毒疫苗、猪流行腹泻病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒和猪瘟病毒等无交叉反应。利用本发明专利技术的检测方法进行灵敏度测试，发现该套引物灵敏度达到50拷贝/μL。本发明专利技术筛选到的引物灵敏度高、特异性强，建立的检测方法具有准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点，从样品处理到报告结果只需1h，操作简单，不需中途开盖，避免污染。

LAMP detection primer for specific detection of porcine pseudorabies virus * and its application, reagent and method

The invention relates to the field of biotechnology, in particular to a LAMP detection primer for specific detection of porcine pseudorabies virus, and its application, detection reagent and method. The sequence of the LAMP detection primers is shown as SEQ ID NO:1-SEQ ID NO:6. The primer group can accurately detect wild pseudorabies virus and cross react with porcine pseudorabies virus, porcine epidemic diarrhea virus, porcine reproductive and respiratory syndrome virus, porcine parvovirus, porcine circovirus and hog cholera virus. The detection method of the invention is used for sensitivity testing, and the sensitivity of the set of primers is found to be up to 50 copies/mu L. The primers screened by the invention have high sensitivity and specificity, and the established detection method has the advantages of high accuracy, short detection time and real-time observation of results. It takes only 1 hour from sample processing to report results, and is simple to operate, without opening the lid halfway, and avoids pollution.

【技术实现步骤摘要】
特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法
本专利技术涉及生物
，特别涉及特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。
技术介绍
猪伪狂犬病(Pseudorabies，PR)是由伪狂犬病毒(PseudorabiesVirus，PRV)引起的多种家畜和野生动物以发热、奇痒(猪除外)及脑脊髓炎为主要症状的一种急性传染病。该病对不同年龄的猪都有危害，成年猪耐过后成为长期的带毒、排毒污染源。仔猪病死率100％。世界动物卫生组织(OIE)将该病列为B类动物疫病，我国将其列为二类动物疫病。一些专家认为，全世界由PR造成的损失每年可达几十亿美元，仅低于口蹄疫(FMD)和猪瘟(CSF)。PRV属于疱疹病毒科、甲型疱疹病毒亚科、水痘病毒属。PRV基因组为双股线状DNA，基因组大小约为150kb，G+C含量高达70％以上，包含的开放阅读框在70个以上，能够编码70～100种蛋白质，成熟的病毒粒子约有50种蛋白质。已发现的11种糖蛋白中，gB、gD、gH、gL、gK为病毒增殖必需的糖蛋白；gE、gI、gG、gC、gM、gN为非必需糖蛋白此类蛋白为决定毒力因素的因子。其中gE基因是PRV的主要毒力决定因子，是至今发现的所有野毒株都表达的一种糖蛋白，也是世界动物卫生组织所规定基因缺失疫苗的缺失基因，因此可以通过检测gE基因来区分猪伪狂犬病毒疫苗与野毒感染。目前PRV的常规检测方法包括：1)病原学诊断，即病毒分离﹑病毒接种及动物感染，被称为诊断PRV的黄金标准；2)血清学方法：琼脂免疫扩散试验(AGID)、中和试验(NT)、乳胶凝集试验(LAT)、酶联免疫吸附试验(ELISA)；3)聚合酶链式反应(PCR)、巢式PCR、taqman探针法等。但是病毒分离鉴定由于费时费力而不适于临床检测；由于病毒感染特异性抗体出现较晚，血清学方法也难以用于早期诊断，而且容易出现交叉反应。常规的PCR、巢式PCR等扩增反应后需要电泳检测，耗时较长；taqman探针法特异性高，灵敏度也很好，但是探针只能与具有相应核苷酸碱基互补序列的核酸片段进行结合，所以一旦病毒出现细微碱基变异，就很难被检测到。所以探针的覆盖度很难保证。只有多个探针检测一个指标才可以提高覆盖度，但是这样成本太高。环介导等温扩增法(loop-mediatedisothermalamplification，LAMP)是利用一种具有链置换活性和瀑布式核酸扩增功能的BstDNA聚合酶，在等温条件下进行核酸的变性和自动循环的链置换核酸扩增反应。LAMP针对靶序列的6个区域设计4条特异引物，利用具备链置换功能的DNA聚合酶在恒定温度下不断复制扩增DNA。为了提高反应效率，可在反应体系中添加两条环引物，使之分别与茎环结构结合，启动链置换合成，循环复制。目前仅有一个利用LAMP技术检测猪伪狂犬病毒的专利被授权，该专利(用于检测猪伪狂犬病毒的LAMP试剂盒及其制备方法)在反应结束后的体系中加入SYBRGreenI染料通过观察浊度和颜色变化的方法来检测扩增产物，但此过程必须开盖添加染料，极其容易污染环境，对弱阳性的判断不够准确；此外该专利反应产物还通过EB染色进行电泳观察结果，操作繁琐，耗时较长。
技术实现思路
有鉴于此，本专利技术提供了特异检测猪伪狂犬病毒的LAMP检测引物及其应用、检测试剂和方法。该LAMP检测引物可精确检测猪伪狂犬病毒野毒，与其它病毒无交叉反应，且具有灵敏度高、特异性强、准确率高、检测时间短、结果可实时观测的优点。为了实现上述专利技术目的，本专利技术提供以下技术方案：本专利技术提供了LAMP检测引物，该引物的序列如下：外引物PRV-F3：序列如SEQIDNO：1所示；外引物PRV-B3：序列如SEQIDNO：2所示；内引物PRV-FIP：序列如SEQIDNO：3所示；内引物PRV-BIP：序列如SEQIDNO：4所示；环引物PRV-LF：序列如SEQIDNO：5所示；环引物PRV-LB：序列如SEQIDNO：6所示。本专利技术在LAMP反应前的体系中加入荧光染料，结合荧光定量实现全程实时监控，1小时之内即可出结果。检测灵敏度可以达到50拷贝/μL。该方法既具有简便、快速、灵敏、特异的优势，又避免了人为判定引起的误差以及开盖引起的环境污染。众所周知LAMP技术中，引物是决定检测结果灵敏度和特异性的关键因素。PRV基因组GC含量70％左右，常规PCR扩增难度大，对于需要4-6条的LAMP体系难度更大。而且利用引物设计软件设计不出符合要求的LAMP引物，所以通过人工比对分析猪伪狂犬病毒的gE基因的保守区段，手动设计多套LAMP引物，最终筛选出一套特异性好，灵敏度高的引物。该套引物不仅可区分猪流感病毒(SIV)、高致病猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪圆环病毒(PCV2)和猪瘟病毒(CSFV)等病毒，也可区分猪伪狂犬病毒疫苗，防止未感染的免疫猪被误杀。本专利技术还提供了该LAMP检测引物在制备猪伪狂犬病毒检测试剂中的应用。本专利技术还提供了一种猪伪狂犬病毒检测试剂，包括本专利技术提供的LAMP检测引物。作为优选，该猪伪狂犬病毒检测试剂还包括反应缓冲液、模板DNA、、不含RNA酶的水。作为优选，猪伪狂犬病毒检测试剂的反应体系为：外引物：各0.10～0.15μL；内引物：各0.9～1.0μL；环引物：各0.35～0.45μL；反应缓冲液：10μL；模板DNA：2μL；不含RNA酶的水：补足至20μL。优选地，猪伪狂犬病毒检测试剂的反应体系为：外引物：各0.12μL；内引物：各0.96μL；环引物：各0.4μL；反应缓冲液：10μL；模板DNA：2μL；不含RNA酶的水：补足至20μL。作为优选，外引物的浓度为0.25～0.35mM，内引物的浓度为2.2～2.6mM，环引物的浓度为0.9～1.1mM。优选地，外引物的浓度为0.3mM，内引物的浓度为2.4mM，环引物的浓度为1mM。作为优选，反应缓冲液为2×反应缓冲液。作为优选，猪伪狂犬病毒检测试剂的检测反应条件为：60℃～65℃恒温反应50min。优选地，猪伪狂犬病毒检测试剂的检测反应条件为：65℃恒温反应50min。本专利技术还提供了一种以非诊断目的的检测猪伪狂犬病毒的方法，使用本专利技术LAMP检测引物或者猪伪狂犬病毒检测试剂进行LAMP扩增。作为优选，检测猪伪狂犬病毒的方法的反应体系为：外引物：各0.10～0.15μL；内引物：各0.9～1.0μL；环引物：各0.35～0.45μL；反应缓冲液：10μL；模板DNA：2μL；不含RNA酶的水：补足至20μL。优选地，检测猪伪狂犬病毒的方法的反应体系为：外引物：各0.12μL；内引物：各0.96μL；环引物：各0.4μL；反应缓冲液：10μL；模板DNA：2μL；不含RNA酶的水：补足至20μL。作为优选，外引物的浓度为0.25～0.35mM，内引物的浓度为2.2～2.6mM，环引物的浓度为0.9～1.1mM。优选地，外引物的浓度为0.3mM，内引物的浓度为2.4mM，环引物的浓度为1mM。作为优选，反应缓冲液为2×反应缓冲液。作为优选，检测猪伪狂犬病毒的检测反应条件为：60℃～65℃恒温反应50min。优选地，检测猪伪狂犬病毒的检测反应条件为：本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.LAMP检测引物，其特征在于，所述引物的序列如下：外引物PRV‑F3：序列如SEQ ID NO：1所示；外引物PRV‑B3：序列如SEQ ID NO：2所示；内引物PRV‑FIP：序列如SEQ ID NO：3所示；内引物PRV‑BIP：序列如SEQ ID NO：4所示；环引物PRV‑LF：序列如SEQ ID NO：5所示；环引物PRV‑LB：序列如SEQ ID NO：6所示。

【技术特征摘要】
1.LAMP检测引物，其特征在于，所述引物的序列如下：外引物PRV-F3：序列如SEQIDNO：1所示；外引物PRV-B3：序列如SEQIDNO：2所示；内引物PRV-FIP：序列如SEQIDNO：3所示；内引物PRV-BIP：序列如SEQIDNO：4所示；环引物PRV-LF：序列如SEQIDNO：5所示；环引物PRV-LB：序列如SEQIDNO：6所示。2.如权利要求1所述LAMP检测引物在制备猪伪狂犬病毒检测试剂中的应用。3.一种猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，包括权利要求1所述LAMP检测引物。4.根据权利要求3所述的猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，还包括反应缓冲液、模板DNA、不含RNA酶的水。5.根据权利要求4所述的猪伪狂犬病毒检测试剂，其特征在于，所述猪伪狂犬病毒检测试剂的反应体系为：外引物：各0.10～0.15μL；内引物：各0.9～1.0μL；环引物：各0.35～0.45μL；反应缓冲液：10μL；模板DNA：2μL；不含RNA酶...

【专利技术属性】
技术研发人员：张岩，马银平，陈燕旌，邢婉丽，程京，边素莹，
申请(专利权)人：博奥生物集团有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11