本发明专利技术公开了一种对沙眼衣原体生长具有特异性抑制作用的重组噬菌体衣壳蛋白1 (Recombinant phage capsid protein1，R‑phage‑Cp1)及制备方法与用途。本发明专利技术应用分子克隆等基因工程技术，从豚鼠结膜炎衣原体噬菌体（phiCPG1）基因组中用PCR技术克隆出其衣壳蛋白1基因，进行针对沙眼衣原体PmpI的修饰，成为拟沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白基因1。其与原核表达质粒pet30a(+)定向连接构建表达载体。表达纯化出的重组噬菌体衣壳蛋白1(R‑phage‑Cp1）作用于沙眼衣原体标准株D‑K型和临床分离株，大肠杆菌、支原体等多种微生物，结果证实R‑phage‑Cp1蛋白对沙眼衣原体具有明显的特异性抑制作用。体内动物实验显示R‑phage‑Cp1蛋白对沙眼衣原体在恒河猴生殖道的感染具有一定的治疗作用。该蛋白有望用于临床治疗沙眼衣原体的泌尿生殖道感染，从而改善沙眼衣原体泌尿生殖道感染迁延难治、易于复发和耗资巨大的现状。
Recombinant Chlamydia phage capsid protein 1 and preparation method and use thereof
The invention discloses a recombinant phage capsid protein 1 (R_phage_Cp1) with specific inhibitory effect on the growth of Chlamydia trachomatis, and a preparation method and application thereof. The present invention uses molecular cloning and other genetic engineering techniques to clone the capsid protein 1 gene from the genome of Chlamydia conjunctivitis phage (phiCPG1) of guinea pig by polymerase chain reaction and modify the PmpI of Chlamydia trachomatis to become the capsid protein gene 1 of Chlamydia trachomatis phage. Its expression vector is directed to the prokaryotic expression plasmid pet30a (+). The recombinant phage capsid protein 1 (R_phage_Cp1) expressed and purified acted on Chlamydia trachomatis standard strain D_K and clinical isolates, Escherichia coli, Mycoplasma and other microorganisms. The results showed that R_phage_Cp1 protein had obvious specific inhibitory effect on Chlamydia trachomatis. Animal experiments in vivo showed that R_phage_Cp1 protein had a certain therapeutic effect on Chlamydia trachomatis infection in the reproductive tract of rhesus monkeys. The protein is expected to be used in the clinical treatment of Chlamydia trachomatis urogenital tract infection, thus improving the status of Chlamydia trachomatis urogenital tract infection protracted refractory, easy to relapse and costly.
【技术实现步骤摘要】
重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1及制备方法与用途
本专利技术涉及生物医药
，具体地说是涉及一种针对沙眼衣原体有特异抑制作用的重组衣原体噬菌体外膜R-phage-Cp1蛋白及其制备方法与用途。
技术介绍
本专利技术涉及生物医药
，具体地说是涉及一种针对沙眼衣原体有特异抑制作用的重组衣原体噬菌体外膜R-phage-Cp1蛋白及其制备方法与用途。沙眼衣原体(Chlamydiatrachomatis,简写为C.t)泌尿生殖道感染是近年来国内外最常见的性传播疾病，据WHO估计，世界上每年约新增8900万衣原体感染患者。我国在20～64岁人群进行全国范围的抽样研究得出性工作者C.t感染率为38%。2010年美国统计有426/10万人衣原体感染者，超过美国人口的0.4%，成为所有疾病中前5位的疾病。泌尿生殖道C.t感染主要引起男性尿道炎和女性粘液脓性宫颈炎。C.t的慢性迁延感染可以引起一系列严重的并发症和后遗症，表现为男性附睾炎、前列腺炎、直肠炎和女性子宫内膜炎、输卵管炎、不孕症、异位妊娠、流产、盆腔炎性疾病和垂直传播等。据世界卫生组织研究报道,不孕妇女中C.t感染率为18%～20%。沙眼衣原体感染的临床症状轻，病情隐匿，但迁延难愈。由于沙眼衣原体特殊的生物学特性，抗菌素治疗的效果并不令人满意，难以将其从人体彻底清除。随着近年来耐药C.t株的报道越来越多，许多学者把精力投入到了衣原体预防性和治疗性疫苗的研究中，包括蛋白疫苗、多肽疫苗、亚单位疫苗，甚至DNA疫苗，但迄今为止尚未获得具有免疫保护作用的疫苗。沙眼衣原体感染已成为威胁人类的公共健康难题。国际衣原体流行趋势和新近研究显示：把衣原体这一具有特殊生物学特性的病原体作一般细菌给予抗菌素治疗可能没有前途,衣原体噬菌体可能会成为解决这个难题最重要的途径，有研究显示豚鼠结膜炎衣原体的噬菌体phiCPG1能够使宿主衣原体的生活周期受到抑制，使具有感染性的原体减少，因此国内外都聚焦在衣原体噬菌体的发现和研究上，但迄今为止尚未发现沙眼衣原体噬菌体。衣原体噬菌体上的三种衣壳蛋白1，2，3，由开放读码框1、2、3编码，在衣原体噬菌体phiCPG1与CPAR39之间相似性高达99.5%，在噬菌体Chp2与Chp3之间的相似性也很高，目前认为该蛋白可能是潜在的受体结合区，与噬菌体对宿主的黏附、植入和识别过程有关。
技术实现思路
本专利技术的目的旨在为克服临床目前治疗沙眼衣原体的困境，选择对宿主衣原体生长周期具有抑制作用的噬菌体phiCPG1为研究对象进行优化，提供对沙眼衣原体生长具有抑制作用的重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）及制备方法与用途。本专利技术通过实验研究证实，所R-phage-Cp1对沙眼衣原体生长具有明显的抑制作用，具有重要的科研和临床价值。为实现本专利技术的目的，本专利技术公开了一种对沙眼衣原体生长有特异抑制作用的衣原体噬菌体重组衣壳蛋白1（R-phage-Cp1），其特征在于该蛋白是从含有重组质粒/pet30a（+）的大肠杆菌中原核重组表达，并通过纯化得到的单一蛋白。本专利技术还公开了一种制备所述重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的方法，其特征在于从豚鼠结膜炎衣原体噬菌体phiCPG1提取噬菌体基因组DNA，PCR扩增出编码衣壳蛋白1的基因，针对沙眼衣原体衣壳蛋白1进行修饰成拟沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1基因，再克隆到pet30a（+）载体质粒中构建成原核表达的重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌后，IPTG诱导表达蛋白，然后经过SDS-PAGE纯化本专利技术所述针对沙眼衣原体的重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）可以在泌尿生殖道沙眼衣原体感染性疾病的预防和治疗中应用。本专利技术基于现有技术的研究基础，构建针对沙眼衣原体的噬菌体衣壳蛋白1的重组质粒，原核表达并纯化得到蛋白，通过一系列体外细胞实验证实该重组噬菌体蛋白能够特异抑制沙眼衣原体标准株D-K型和临床野生株的生长，而对大肠杆菌、McCoy细胞等的生长没有抑制作用；通过恒河猴体内实验证实蛋白对沙眼衣原体感染具有一定的治疗作用。【附图说明】图1：扩增出的拟沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1基因；图2：基因和质粒pet30a（+）的双酶切；图3：重组质粒-pet30a(+)的双酶切鉴定；图4：重组质粒-pet30a(+)的PCR扩增鉴定；图5：重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的鉴定；图6：纯化后的重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的鉴定【具体实施方式】本专利技术从豚鼠结膜炎衣原体噬菌体phiCPG1中提取噬菌体基因组DNA，PCR扩增出编码衣壳蛋白1的基因，进行针对沙眼衣原体外膜蛋白的修饰成拟沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1基因，克隆到pet30a（+）载体质粒中构建成原核表达的重组质粒。重组质粒转化至大肠杆菌后，IPTG诱导表达蛋白。重组表达的蛋白结构描述如下：（1）序列特征长度：553aa类型：蛋白质（2）分子类型：氨基酸（3）豚鼠结膜炎衣原体噬菌体phiCPG1基因组DNA来自美国马里兰大学Patrick教授实验室。（4）蛋白的氨基酸序列描述如下：MVRNRRLPSVMSHSFAQVPSARIQRSSFDRSCGLKTTFDA40GYLIPIFCDEVLPGDTFSLKEAFLARMATPIFPLMDNLRL80DTQYFFVPLRLLWSNFQKFCGEQDNPGDSTDFLTPVLTAP120SGGFIEGSIHDYLGLPTKVAGIECVAFWHRAYNLIWNQYY160RDENIQESVDVEMGDTTSNEVNNYKLLKRGKRYDYFTSCL200PWPQKGPAVTIGVGGIVPVQGLGIQWGNSSAPNPITASSW240INSVNPTFINSTTPTPTGTNKILNYGQAYYIKKPGEATTD280PTPRAYVDLGSTSPVTINSLREAFQLQKLYERDARGGTRY320IEIIRSHFNVQSPDARLQRAEYLGGSSTPVNISPIPQTSS360TDSTSPQGNLAAYGTAIGSKRVFTKSFTEHGVILGLASVR400ADLNYQQGLDRMWSRRTRWDFYWPALSHLGEQAVLNKEIY440CQGPAVKDAQNGNVVVDEQVFGYQERFAEYRYKTSKITGK480FRSNATGSLDAWHLAQQFENLPTLSPEFIEENPPMDRVVA520VDTEPDFLLDGWFSLRCARPMPVYSVPGLIDHF553一、重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的制备和鉴定1.重组沙眼衣原体噬菌体衣壳蛋白1（R-phage-Cp1）的制备①含有phiCPG1噬菌体的衣原体GPIC株培养后，收集上清液，4℃30000rpm离心30min，0.22um滤膜过滤除菌，随后加入DnaseI，37℃作用1hr，在4℃下100000rpm离心3hr，收集phiCPG1沉淀颗粒，加蛋白酶K后37℃作用1hr。用酚氯仿抽提，乙醇沉淀制备噬菌体单链DNA，－20℃储存备用。②设计基因的扩增引物P15’AGTAGGGAAGCCATGGTTAGGAGG3’；P25’ACT本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种对沙眼衣原体生长有抑制作用的重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1(R‑phage‑Cp1），其特征在于该蛋白是从含有重组质粒/pet30a（+）的大肠杆菌中原核重组表达，并通过纯化得到的单一蛋白。
【技术特征摘要】
1.一种对沙眼衣原体生长有抑制作用的重组衣原体噬菌体衣壳蛋白1(R-phage-Cp1），其特征在于该蛋白是从含有重组质粒/pet30a（+）的大肠杆菌中原核重组表达，并通过纯化得到的单一蛋白。2.按照权利要求1所述的R-phage-Cp1蛋白，其特征在于所说的R-phage-Cp1蛋白氨基酸序列如说明书核苷酸和氨基酸序列表所示。3.按照权利要求1所述的R-phage-Cp1蛋白，其特征在于所说的原核表达载体为pet30a（+）。4.一种按照权利要求1所述R-pha...
【专利技术属性】
技术研发人员：刘全忠，刘原君，
申请(专利权)人：刘全忠，刘原君，
类型：发明
国别省市：天津,12
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