人工改造的PCV2 Cap蛋白、重组病毒及其应用制造技术

本发明专利技术涉及基因工程技术领域，特别涉及表达人工改造的PCV2 Cap蛋白的核苷酸序列，如序列表中序列2或序列3。人工改造的PCV2 Cap蛋白，是序列表中序列2或序列3经过表达后得到的。表达人工改造的PCV2 Cap蛋白的核苷酸序列的重组病毒。人工改造的PCV2 Cap蛋白或重组病毒在PCV2免疫疫苗中的应用。本发明专利技术筛选获得一株重组杆状病毒，能有效表达Cap蛋白，表达的重组Cap蛋白具有良好的免疫原性，并能够自组装成病毒样粒子，为PCV2亚单位疫苗的研发打下了基础。

【技术实现步骤摘要】
人工改造的PCV2Cap蛋白、重组病毒及其应用
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种人工改造的PCV2Cap蛋白，还涉及含有此蛋白编码基因的重组病毒，还涉及人工改造的PCV2Cap蛋白及重组病毒的应用。
技术介绍
猪圆环病毒1型和2型(PCV1和PCV2)非常小，直径只有17nm左右，呈球状，不具有囊膜。其基因组为单链环状DNA，大约由1760个核苷酸构成，至少编码两个开放阅读框，分别是ORF1和ORF2。其中ORF1编码Rep蛋白，与病毒DNA复制有关。ORF2编码Cap蛋白，与病毒粒子的装配相关。猪圆环病毒病(PCVD)在全球范围内广泛流行，给养殖业带来了巨大的经济损失。PCV2是导致该疾病的主要病原因子，对猪体进行PCV2疫苗免疫是较为有效的预防手段。传统的疫苗种类包括弱毒苗和灭活苗，两者的制备都需要大规模地培养病原微生物，在生产应用上存在一定的风险。重组亚单位疫苗因不含有病原微生物及其遗传物质，所以不存在上述风险。杆状病毒-昆虫细胞表达系统(BEVS)是一个高效的表达系统，能够表达具有生物活性的大分子蛋白质，已被广泛地用于生产病原微生物的抗原。近来，已有多种基于该平台的疫苗得到了商品化，比如Merck的猪瘟苗Porcilis和B.Ingelheim的圆环苗杆状病毒的宿主范围较窄，不能够在脊椎动物体内复制，具有较高的安全性。BEVS表达的蛋白容易自组装成病毒样颗粒，VLP能够被宿主细胞的TLRs和PRRs识别，进而激活先天性免疫机制。此外，由于VLP具有规则的表面结构，所以能够有效地使B细胞表面的免疫球蛋白分子相互交联，进而诱导强烈的B细胞反应。VLPs还有利于抗原递呈细胞(特别是树突状细胞)的抗原递呈作用，进而将抗原分子展示给免疫细胞。Cap蛋白是PCV2的主要免疫原性蛋白，具有多个表位。最近，研究人员使用了多种表达系统来表达Cap蛋白，从而制备PCV2亚单位疫苗，比如大肠杆菌和重组病毒载体疫苗(杆状病毒和伪狂犬病毒)。尽管每种表达系统都具有独特的优势，但是也存在一些不足限制了重组亚单位疫苗的开发利用。比如大肠杆菌表达系统操作简单、产量高，但是表达的蛋白不能够正确的折叠和加工，而这些对抗原天然构象的形成是必不可少的。杆状病毒表达系统能够表达多种病毒的结构蛋白，进而形成病毒样颗粒(VLPs)。目前国外已有两种基于杆状病毒表达系统的PCV2亚单位疫苗得到了商品化，应用效果良好。我国也已有采用该表达系统表达PCV2Cap蛋白的研究报道，但其表达水平较低，疫苗生产成本较高。
技术实现思路
为了解决以上现有技术中PCV2Cap蛋白表达水平较低，疫苗免疫免疫效果不够理想的问题，本申请公开了一种人工改造的PCV2Cap蛋白，还涉及含有此蛋白编码基因的重组病毒，还涉及人工改造的PCV2Cap蛋白及重组病毒的应用。本专利技术是通过以下步骤得到的：表达人工改造的PCV2Cap蛋白的核苷酸序列，如序列表中序列2或序列3。人工改造的PCV2Cap蛋白，是序列表中序列2或序列3经过表达后得到的。含有、所述的表达人工改造的PCV2Cap蛋白的核苷酸序列的重组病毒。所述的重组病毒的构建方法，包括以下步骤：(1)以含有序列表中序列1的核苷酸序列的PCV2ORF2基因为模板，以下述的引物对中的一对进行PCR扩展，PCR产物经纯化后酶切克隆入pFastBac载体，转化大肠杆菌DH5α，选取阳性质粒得到重组质粒；(2)重组质粒转化感受态细胞DH10Bac，培养，进行蓝白斑筛选，按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的碱裂解法提取重组载体骨架Bacmid，转染昆虫细胞，出现病变的昆虫细胞即为重组病毒；所述引物对的核苷酸序列如下：KozakandMutationS:5’-CGCTCGAGATCAAAATGGCCTACCCCC-3’,KozakR:5’-AGGGTACCTCACTTGGGGTTCAG-3’。或：KozakS:5’-CGCTCGAGATCAAAATGACCTACCCCC-3’，KozakR:5’-AGGGTACCTCACTTGGGGTTCAG-3’。所述的人工改造的PCV2Cap蛋白或者所述的重组病毒在PCV2免疫疫苗中的应用。从重组病毒中获取PCV2Cap蛋白，制备成疫苗。重组病毒细胞中加入PBS溶液得到细胞悬液，吹下细胞，对细胞悬液进行超声波裂解，得到含有PCV2Cap蛋白的细胞裂解液，以CP974S水佐剂为基础，配制佐剂，将佐剂与等体积的细胞裂解液混合，制备动物免疫用疫苗。所述免疫疫苗为重组亚单位疫苗。本专利技术的有益效果：1)其中重组杆状病毒rBcapokm为研制PCV2亚单位疫苗奠定了重要基础。为了提高PCV2Cap蛋白表达水平和抗原性，本专利技术根据昆虫细胞密码子的偏嗜性对Cap蛋白的基因进行优化，设计了7种含Cap蛋白的基因分子，构建重组病毒，筛选获得两株重组杆状病毒，能有效表达Cap蛋白，具有良好的免疫原性，并能够自组装成病毒样粒子，为PCV2亚单位疫苗的研发打下了基础；2)本专利技术构建成功的昆虫杆状病毒表达系统制备的PCV2亚单位疫苗，进行动物免疫试验。小鼠免疫试验表明，重组蛋白均可诱导产生高水平的ELISA抗体和中和抗体。该重组Cap蛋白具有较好的免疫保护效果，具有很好的开发和应用前景。附图说明图1为Cap基因扩增，图2为目的基因的扩增结果，A:M.DL5000DNAmarker；1.pVax-cap双酶切产物(BamHI和XhoI)；2.pVax双酶切产物(BamHI和XhoI)；B:M.100bpDNAmarker；1.CapomPCR产物；C:M.100bpDNAmarker；1.Capo/bNLSPCR产物；D:M.DL2000DNAmarker；1.CapokPCR产物；2.CapokmPCR产物；E:M.DL2000DNAmarker；1.CapoEmPCR产物；2.Capo△NLSPCR产物，图3重组载体质粒的鉴定，其中A:M1.DL2000DNAmarker；1.pFastBacHTB-Capo双酶切产物(BamHI和XhoI)；2.pFastBacHTB双酶切产物(BamHI和XhoI)；M2.DL15000DNAmarker.B:M1.DL2000DNAmarker；1.pFastBacHTB-Capom双酶切产物(BamHI和XhoI)；2.pFastBacHTB双酶切产物(BamHI和XhoI)；M2.DL15000DNAmarker.C:M1.DL2000DNAmarker；1.pFastBacDual-Capo/bNLS双酶切产物(XhoI和kpnI)；2.pFastBacDual双酶切产物(XhoI和kpnI)；M2.DL15000DNAmarker.D:M1.DL2000DNAmarker；1.pFastBacDual-Capok双酶切产物(XhoI和kpnI)；2.pFastBacDual双酶切产物(XhoI和kpnI)；M2.DL15000DNAmarker.E:M1.DL2000DNAmarker；1.pFastBacDual-Capokm双酶切产物(XhoI和kpnI)；2.pFastBacDual双酶切产物(XhoI和kpnI)；M2.DL15000DNAma本文档来自技高网...

【技术保护点】
表达人工改造的PCV2 Cap蛋白的核苷酸序列，如序列表中序列2或序列3。

【技术特征摘要】
1.表达人工改造的PCV2Cap蛋白的核苷酸序列，如序列表中序列2或序列3。2.人工改造的PCV2Cap蛋白，是序列表中序列2或序列3经过表达后得到的。3.含有权利要求1中所述的表达人工改造的PCV2Cap蛋白的核苷酸序列的重组病毒。4.一种权利要求3所述的重组病毒的构建方法，其特征在于包括以下步骤：（1）以含有序列表中序列1的核苷酸序列的PCV2ORF2基因为模板，以下述的引物对中的一对进行PCR扩展，PCR产物经纯化后酶切克隆入pFastBac载体，转化大肠杆菌DH5α，选取阳性质粒得到重组质粒；（2）重组质粒转化感受态细胞DH10Bac，培养，进行蓝白斑筛选，按Bac-to-Bac杆状病毒表达系统中的碱裂解法提取重组载体骨架Bacmid，转染昆虫细胞，出现病变的昆虫细胞即为重组病毒；所述引物对的核苷酸序列如下：KozakandMutationS:5’-CGCTCGAGATCAAAATGGCCT...

【专利技术属性】
技术研发人员：白娟，董彦鹏，肖澄，
申请(专利权)人：江苏南农高科技股份有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32