小分子多肽及其应用制造技术

本发明专利技术涉及一种小分子多肽，其成熟肽的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。本发明专利技术还公开了上述小分子多肽作为抗结核杆菌药物中的应用。本发明专利技术中的分枝杆菌噬菌体来源的抗结核杆菌小分子多肽具有分子量小，合成成本低，抗结核杆菌H37Rv的效果明显，对利福平耐药的H37Rv也具有杀灭作用，且对其他正常的革兰氏阳性菌、阴性菌和真菌没有影响，在制备抗结核药物中具有较好的应用前景。

Small molecule peptide and its application

The invention relates to a small molecule polypeptide, amino acid sequence of the mature peptide is shown as SEQ ID No.1. The invention also discloses the application of the small molecule polypeptide as an anti tuberculosis drug. Anti Mycobacterium tuberculosis polypeptide Mycobacteriophages source of the invention has small molecular weight, low synthesis cost, anti Mycobacterium tuberculosis H37Rv effect, also has bactericidal effects on rifampicin resistant H37Rv, and has no effect on other gram positive bacteria, normal negative bacteria and fungi, and has good application prospects in preparation of anti tuberculosis drugs.

【技术实现步骤摘要】
小分子多肽及其应用
本专利技术涉及生物医学领域，尤其涉及一种小分子多肽及其应用。
技术介绍
结核病被列为全世界重大传染病之一。结核杆菌是引起该病的病原菌，可感染全身器官，但以肺结核最为常见，是一种严重的呼吸道传染疾病。由于常规BCG疫苗对肺结核预防的无效性，结核耐药菌株的出现以及HIV感染导致的结核合并感染，肺结核的发病及死亡目前居高不下，形势十分严重。全球有1/3的人口感染结核杆菌，大约有10％感染者表现出临床症状。每年都会有900万新增结核杆菌感染病例，有200万人死于结核病。结核病仍然是当今威胁人类健康的一个主要的传染病杀手。目前世界卫生组织提倡使用的一线抗结核药有异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、链霉素、乙胺丁醇和氨硫脲等。这些药物虽然十分有效，但是由于近年抗结核药物的不规范使用导致耐药性结核菌株的变异和流行，出现了严重的结核杆菌耐药性问题。异烟肼主要通过抑制菌体细胞壁分枝菌酸的合成，致细胞壁缺损而死亡；利福平则与依赖DNA的RNA多聚酶的β亚单位牢固结合，防止该酶与DNA连接，抑制细菌RNA的合成，从而阻断RNA转录过程，致使DNA和蛋白的合成停止而死亡。两者的抗菌机理均抑制结核杆菌代谢过程中关键细胞结构组分的合成，这类抗菌机理极易诱发微生物的耐药性。在过去的几十年里，对付耐药性结核病的进展非常缓慢，全球范围内每五名耐药性患者中只有一人可以被准确诊断出来。耐药结核菌株的出现，使病程延长，死亡危险性上升，还可能会导致长期传染性，扩大耐药性传播的机会，增加治疗费用。随着耐药结核菌株的快速增长和缺乏有效的新的抗结核药，亟待研发具有独特杀菌机制的生物类抗结核药物。抗菌肽的独特抗菌机理，使其成为当前世界上新型抗感染药物研发的热点。抗菌肽主要是通过其两亲性的螺旋结构和净正电荷相互作用直接结合在微生物细胞膜表面，改变微生物细胞膜的通透性，导致微生物细胞渗透压发生改变，形成穿孔而导致细胞质外流。该杀菌机理不同于传统抗生素通过抑制微生物代谢、蛋白质合成等方式，因此其杀菌速度快(目前已报道的抗菌肽中有的可以在不到一分钟内发挥杀菌效果，而作为阳性对照的抗生素需要至少3小时)，较短的杀菌时间很难导致微生物耐药。抗生素诱发微生物释放内毒素从而导致脓毒症的产生，而抗菌肽不仅不诱发内毒素的释放，还可中和内毒素，不诱发脓毒症。因此，以抗菌肽抑制结核分枝杆菌具备杀菌直接、速度快、不易诱导耐药性的良好特性。噬菌体(Bacteriophage)作为一种专性寄生于细菌的病毒，已经进化出一种可以与宿主细菌相互作用的独特机制，富含着丰富的生物活性物质，包括许多活性多肽和蛋白，是筛选抗结核杆菌多肽的良好资源库。目前已经有报道来源于噬菌体基因编码的多肽和蛋白，能够快速杀死细菌。还有一些噬菌体来源的多肽和蛋白能够靶向作用于细菌的代谢过程，抑制细菌生长的作用。我国研究人员对26种铜绿假单胞杆菌噬菌体的基因组进行测序，鉴定出了31个多肽，这些多肽可以靶向作用于DNA的复制与RNA的转录，从而抑制细菌的生长与增殖。目前需要寻找多种作用于结核杆菌的多肽与蛋白，特别是发现一些有效的小分子多肽，为研发新型生物类抗结核(辅助)药物提供优秀模板分子，同时降低多肽药物研发的成本。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种小分子多肽及其应用，该小分子多肽分子量小，合成成本低，抗结核杆菌效果明显，对其他细菌和真菌没有影响，在制备抗结核药物中具有较好的应用前景。本专利技术的一种小分子多肽，其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。其分子量为1827.25Da，等电点为12.03。将其命名为AK15。进一步地，序列中的氨基酸均为L-型。进一步地，AK15小分子多肽来源于分枝杆菌噬菌体。进一步地，分枝杆菌噬菌体为分枝杆菌噬菌体Che12或分枝杆菌噬菌体Adzzy。进一步地，AK15小分子多肽由分枝杆菌噬菌体Che12基因组(NC_008203.1)中的gp65基因(GeneID:4156925)编码或分枝杆菌噬菌体Adzzy基因组(NC_022058.1)中的ADZZY_66基因(GeneID:16546204)编码。进一步地，AK15小分子多肽的前体由47个氨基酸残基组成(YP_655644.1，YP_008409360.1)。本专利技术还公开了上述AK15小分子多肽在制备抗结核杆菌药物中的应用。进一步地，结核杆菌为结核杆菌H37Rv或H37Ra。AK15对结核杆菌有毒株、无毒株都表现出极强的抗菌活性。AK15对利福平耐受的结核杆菌H37Rv也具有抗菌活性。进一步地，AK15对细菌和真菌没有影响。细菌为金黄色葡萄球菌ATCC6538、金黄色葡萄球菌ATCC25923、枯草芽孢杆菌ATCC6633等革兰氏阳性菌以及大肠杆菌ATCC25922、大肠杆菌ATCC35218、铜绿假单胞菌ATCC27853等革兰氏阴性菌。真菌为白色念珠菌ATCC10231、白色念珠菌ATCC2002等。进一步地，AK15小分子多肽对结核杆菌的最小抑菌浓度为37.5μg/ml。AK15对利福平耐受的结核杆菌H37Rv的最小抑菌浓度也为37.5μg/ml。进一步地，AK15小分子多肽在浓度为37.5-200μg/ml时发挥杀菌效果。进一步地，杀菌时间为14天以下。进一步地，小分子多肽在0-200μg/ml的浓度范围内，对红细胞没有溶血活性，对小鼠腹腔巨噬细胞、RAW264.7和HeLa细胞没有细胞毒性。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：1、本专利技术中的AK15是基于分枝杆菌噬菌体侵染分枝杆菌策略的基础上鉴定到的小分子多肽，来源天然。2、分枝杆菌噬菌体来源的抗结核杆菌小分子多肽AK15具有分子量小，合成成本低的优点。3、本专利技术还公开了上述小分子多肽AK15在作为抗结核杆菌药物中的应用，其能够特异性杀灭结核杆菌，对耐药性结核杆菌同样有效，且对其他正常细菌和真菌没有影响，能够改变结核杆菌细胞膜的形态，使细胞膜的通透性发生改变，对哺乳细胞安全，在制备抗结核药物中具有较好的应用前景。上述说明仅是本专利技术技术方案的概述，为了能够更清楚了解本专利技术的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本专利技术的较佳实施例并配合附图详细说明如后。附图说明图1是本专利技术小分子多肽AK15与结核杆菌细胞结合的测试结果；图2是本专利技术小分子多肽AK15对结核杆菌细胞膜的形态影响结果；图3是本专利技术小分子多肽AK15对结核杆菌细胞膜通透性影响的激光共聚焦测试结果。具体实施方式下面结合附图和实施例，对本专利技术的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本专利技术，但不用来限制本专利技术的范围。实施例1AK15的制备找到编码分枝杆菌噬菌体Che12(MycobacteriumphageChe12)基因组(NC_008203.1)中的gp65的基因(GeneID：4156925)或分枝杆菌噬菌体Adzzy(MycobacteriumphageAdzzy)基因组(NC_022058.1)中的ADZZY_66基因(GeneID:16546204)编码的一种未知功能的直链多肽，其前体由47个氨基酸残基组成(MycobacteriumphageChe12：YP_655644.1，MycobacteriumphageAdzzy：YP_008409360本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种小分子多肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID No.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种小分子多肽，其特征在于：其氨基酸序列如SEQIDNo.1所示。2.根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于：序列中的氨基酸均为L-型。3.根据权利要求1所述的小分子多肽，其特征在于：所述AK15小分子多肽来源于分枝杆菌噬菌体。4.根据权利要求3所述的小分子多肽，其特征在于：所述分枝杆菌噬菌体为分枝杆菌噬菌体Che12或分枝杆菌噬菌体Adzzy。5.根据权利要求1-4中任一项所述的小分子多肽在制备抗结核杆菌药物中的应用。6.根据权利要求5所述...

【专利技术属性】
技术研发人员：卫林，徐薇，
申请(专利权)人：苏州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32