非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用技术

本发明专利技术公开了非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用，该方法利用P11.5多肽表位免疫实验动物如小鼠、兔等制备特异性多克隆抗体。该方法抗原纯度高，制备的抗体特异性强，亲和力高，使用的抗原量少，操作简便。所述的多克隆抗体的制备方法包括ASFV P11.5的特异性抗原表位的选择，多肽抗原的合成，动物免疫，抗体的测定等步骤。与常规方法比较，具有简便快速，抗原纯度高，制备的抗体特异性强，抗原使用量少的优点。该多克隆抗体可以用于非洲猪瘟病毒P11.5蛋白检测，为我国非洲猪瘟的防控提供重要的技术方法。

Preparation and application of specific polyclonal antibody against African swine fever virus P11.5 protein

The invention discloses a preparation method and application of specific polyclonal antibody against African swine fever virus P11.5 protein. The method uses P11.5 polypeptide epitope to immunize experimental animals such as mice and rabbits to prepare specific polyclonal antibody. The method has high antigen purity, strong specificity, high affinity, less antigen quantity and simple operation. The preparation method of the polyclonal antibody includes the selection of specific antigen epitopes of ASFV P11.5, the synthesis of polypeptide antigens, animal immunity and the determination of antibodies. Compared with conventional methods, it has the advantages of simplicity, rapidity, high purity of antigen, strong specificity of prepared antibody and less use of antigen. The polyclonal antibody can be used to detect the P11.5 protein of African swine fever virus and provide an important technical method for the prevention and control of African swine fever in China.

【技术实现步骤摘要】
非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用
本专利技术涉及一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用。
技术介绍
非洲猪瘟又称东非猪瘟或疣猪病，是由非洲猪瘟病毒引起猪的一种急性热型高度接触性传染病。本病仅感染猪，临床症状与病理变化与猪瘟很相似，主要表现为发热、皮肤发绀和淋巴结、肾脏、胃肠道粘膜出血等。本病的死亡率很高，在流行期间可高达100％。目前非洲猪瘟已在30多个国家发生流行，并有继续扩大蔓延的趋势，2018年8月3日我国确诊首例非洲猪瘟疫情。非洲猪瘟的诊断常采用如红细胞吸附试验、直接免疫荧光试验、动物接种试验、间接免疫荧光试验、酶联免疫吸附试验、免疫电泳试验、间接酶联免疫蚀斑试验等，国际上相关特异性试剂缺乏，对控制非洲猪瘟带来许多困难。非洲猪瘟病毒为一种含有囊膜的双链DNA，基因组为线性双链DNA，长度在170～190kb之间，可编码151个蛋白。该病毒是非洲猪瘟病毒科非洲猪瘟病毒属的唯一成员，目前只有1个血清型，但不同地区ASFV分离株基因组存在一定的差异。根据P72基因遗传进化分析，目前可将ASFV分为23个基因型。
技术实现思路
为了克服上述缺陷，本专利技术提供了一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法及应用。P11.5基因比较稳定，在感染细胞中非常丰富，本专利技术利用P11.5基因的表达、多肽合成等建立快速检测非洲猪瘟特异抗体和抗原，以便为检测非洲猪瘟提供优质试剂。为了实现上述专利技术目的，本专利技术采用的技术方案为：一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽，所述的抗原多肽为P11.5-2或者P11.5-1；P11.5-2的序列为PEERCTYKFNSYTKKMEL，P11.5-1的序列为DQEEKKALQNKETKNLGIP。所述的抗原多肽通过合成制得。本专利技术还提供一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白免疫原，所述的免疫原直接由前述的非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽构成；或者，所述的免疫原由所述的非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽和完全佐剂混合而成；或者，所述的免疫原由所述的非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽和不完全佐剂混合而成。本专利技术还公开一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备方法，包括如下步骤：a)选择非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多肽表位：P11.5-1—DQEEKKALQNKETKNLGIP；或P11.5-2—PEERCTYKFNSYTKKMEL；b)合成非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多肽表位；c)将非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多肽表位首先与完全佐剂或不完全佐剂混合后免疫动物；再将非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多肽表位直接免疫动物；d)分离免疫动物的血清，血清中含有抗非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体。优选的，所述的动物为小鼠或家兔。本专利技术还提供前述的方法制备获得的抗非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体以及非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体在制备检测非洲猪瘟病毒抗原和/或抗体试剂盒中的应用。相对于现有技术，本专利技术的有益效果：本专利技术公开了一种快速制备非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体的方法，该方法利用P11.5多肽表位免疫实验动物如小鼠、兔等制备特异性多克隆抗体。该方法抗原纯度高，制备的抗体特异性强，亲和力高，使用的抗原量少，操作简便。所述的多克隆抗体的制备方法包括ASFVP11.5的特异性抗原表位的选择，多肽抗原的合成，动物免疫，抗体的测定等步骤。与常规方法比较，具有简便快速，抗原纯度高，制备的抗体特异性强，抗原使用量少。该多克隆抗体可以用于非洲猪瘟病毒P11.5蛋白检测，为我国非洲猪瘟的防控提供重要的技术方法。具体实施方式下面结合具体的实施例，进一步阐述本专利技术。应理解，这些实施例仅用于说明本专利技术而不用于限制本专利技术的范围。此外应理解在阅读了本专利技术讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本专利技术作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。1.多肽抗原表位的筛选根据医学在线公开的非洲猪瘟病毒P11.5蛋白氨基酸序列，筛选设计具有亲水性好，抗原性强，具有共性的特异性表位，如序列P11.5-1—DQEEKKALQNKETKNLGIP(SEQIDNo.1)，P11.5-2—PEERCTYKFNSYTKKMEL(SEQIDNo.2)。2.多肽抗原表位的合成合成直线多肽，多肽从C端到N端方向合成。1.称取RINK树脂3g(取代度0.3mmol/g)于150ml的反应器中，用50ml的二氯甲烷(DCM)浸泡。2.2小时后，用3倍树脂体积的氮-二甲基甲酰胺(DMF)洗涤树脂，然后抽干，如此重复四次，将树脂抽干后待用。3.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF)，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，然后抽干。4.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。5.称取C端第一个氨基酸适量和1-羟基-苯骈三唑(HOBT)适量于50ml的离心管中，加入20ml的DMF将其溶解，然后加入3ml的N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。6.2小时后，用一定量的醋酸酐封头(醋酸酐：DIEA:DCM＝1：1：2)半小时，然后用3倍树脂体积的DMF洗涤四次，抽干待用。7.向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min，以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干。8.取少量树脂用茚三酮(九井水合茚三酮)法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，树脂有颜色，说明脱保护成功。9.称取后面第二个氨基酸适量和HOBT适量于50ml的离心管中，加入25ml的DMF将其溶解，然后加入2.5ml的DIC振荡摇匀1min，待溶液澄清后加入到反应器中，然后将反应器置于30℃的摇床中反应。10.1小时后，取少量树脂检测，用茚三酮法检测(检A、检B各两滴，100℃反应1min)，若树脂为无色，说明反应完全；若树脂有颜色，说明缩合不完全，继续反应。11.待反应完全后，用DMF洗涤树脂四次，然后抽干，向反应器中加入一定量的20％哌啶(哌啶/DMF＝1:4)，放在脱色摇床上摇晃20min,以此来脱去树脂上的Fmoc保护基团。脱完保护后用DMF洗涤四次，然后抽干检测保护是否脱去。12.按照步骤9-11依次接上后面的氨基酸。13.待接上最后一个氨基酸后，脱去保护，用DMF洗涤四次，然后用甲醇将树脂抽干。然后用95切割液(三氟乙酸:1,2乙二硫醇:3，异丙基硅烷:水＝95:2:2:1)将多肽从树脂上切割下来(每克树脂加10ml切割液)，并用冰乙醚(切割液：乙醚＝1:9)离心沉降四次。最后用HPLC分离纯化，再冻干，得到一定纯度的多肽。其中HPLC分离纯化条件：固定相：C18；流动相的配置：PumpA：V(TFA)/V(水)＝1/1000PumpB:V(TFA)/v(乙腈)＝1/1000；流速：10mL/min；保留时间：2本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽为P11.5‑2或者P11.5‑1；P11.5‑2的序列为PEERCTYKFNSYTKKMEL，P11.5‑1 的序列为DQEEKKALQNKETKNLGIP。

【技术特征摘要】
1.一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽为P11.5-2或者P11.5-1；P11.5-2的序列为PEERCTYKFNSYTKKMEL，P11.5-1的序列为DQEEKKALQNKETKNLGIP。2.根据权利要求1所述的一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽，其特征在于，所述的抗原多肽通过合成制得。3.一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白免疫原，其特征在于，所述的免疫原直接由权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽构成；或者，所述的免疫原由权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽和完全佐剂混合而成；或者，所述的免疫原由权利要求1所述的非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性抗原多肽和不完全佐剂混合而成。4.一种非洲猪瘟病毒P11.5蛋白特异性多克隆抗体的制备...

【专利技术属性】
技术研发人员：秦爱建，沈安宁，周小钰，钱琨，邵红霞，叶建强，
申请(专利权)人：扬州大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32