猪圆环病毒3型抗原表位多肽及其应用制造技术

本发明专利技术公开了猪圆环病毒3型抗原表位多肽及其应用。该抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。本发明专利技术的抗原表位多肽可用于间接法ELISA，使用化学合成抗原肽包被酶标板，抗原用量少、灵敏性和特异性高，可以高效地检测是否存在猪圆环病毒3型抗体，具有敏感性高、特异性好、且操作便捷，具有良好的市场前景。

【技术实现步骤摘要】
猪圆环病毒3型抗原表位多肽及其应用本申请是申请号为“201810004832.9”，专利技术名称为“猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒”的专利申请的分案申请
本专利技术属于生物检测
，更具体地，本专利技术涉及一种猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒。
技术介绍
猪圆环病毒(Porcinecircovirus，PCV)是目前已发现的最小的动物病毒，是圆环病毒科圆环病毒属的重要成员之一。根据其抗原性、核苷酸序列及致病性，可将其分成两个基因型(genotype)：1型和2型，即PCV1和PCV2。其中PCV1无致病性，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系中，而PCV2则是目前对世界养猪业危害极大的病原体之一，给全球的养殖业带来了巨大的经济损失，可引发断奶仔猪多系统衰竭综合征(Postweaningmultisystemicwastingsyndrome，PMWS)、仔猪先天性震颤、猪皮炎肾病综合征、猪呼吸道综合征、母猪繁殖障碍和肠道疾病。PCV成熟的病毒粒子由60个核衣壳蛋白质(Cap)亚基组装成一个直径为17～20nm的正二十面体的球形颗粒，病毒的基因组包裹其中，编码两个主要的开放阅读框(Openreadingframe，ORFs)：cap和rep(复制相关酶)。Cap蛋白是其唯一的结构蛋白和主要抗原，能诱导机体产生有效的免疫保护反应。2016年10月，美国Kansas州立大学和加州大学几乎同时报道一个新的PCV基因型，称为PCV3。该病毒从出现病症的母猪或仔猪中分离得到，同时检测PCV2为阴性，基因序列分析显示，PCV3基因组包括2000碱基，Cap蛋白由214个氨基酸残基组成，比PCV2Cap蛋白少19～20个氨基酸。目前，我国已陆续有有关PCV3的报道，分别在广东、福建、河南、江西、重庆、安徽、湖北、辽宁等地利用PCR的检测方法检测到PCV3存在，因此研发操作简单、特异性好、敏感性高，可大规模推广的PCV3血清抗体检测试剂盒成为检测PCV3抗体的可靠途径之一。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供猪圆环病毒3型抗原表位多肽及其应用。猪圆环病毒3型抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。所述的应用为所述的猪圆环病毒3型抗原表位多肽在制备检测猪圆环病毒3型抗体的间接ELISA检测试剂盒中的应用。其中，用于检测猪圆环病毒3型抗体的间接ELISA检测试剂盒，该试剂盒利用猪圆环病毒3型抗原表位多肽作为包被抗原，建立了一种特异性、敏感性和重复性好的间接ELISA方法，用于检测猪血清中是否含有猪圆环病毒3型抗体。为了达到上述目的，本专利技术首先筛选得到了性能优异的猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物，本专利技术提供的猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物，为序列表中序列2所示的多肽或序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。当所述多肽组合物为序列2所示的多肽或序列3所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1。其中，猪圆环病毒3型抗原表位多肽也是本专利技术的保护范围，所述猪圆环病毒3型抗原表位多肽为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。本专利技术的猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗，其中所述酶联反应板包被有猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物。所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物中的多肽均为化学人工合成得到。所述酶联反应板的最佳制备方法及条件是将所述猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物溶于pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng多肽(其中序列表中序列1所示的多肽为50ng，序列表中序列2所示的多肽为50ng，序列表中序列3所示的多肽为50ng)，2～8℃下放置8～12小时，使多肽抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有1％(g/ml)牛血清白蛋白(BSA)pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。所述阳性对照血清为所述猪圆环病毒3型灭活病毒免疫后采集的猪血清；所述阴性对照血清为无特定病原体(SPF)的猪血清，即无猪圆环病毒的猪血清，包括如无猪圆环病毒的健康猪血清。所述酶标二抗为辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。所述试剂盒还包括底物液A、底物液B和终止液，所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1∶1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。所述试剂盒还包括样品稀释液和浓缩洗涤液(20倍)；样品稀释液为含有0.5％(g/ml)酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液；浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。本专利技术试剂盒的检测程序为：1、平衡：将试剂盒从冷藏环境中取出，置室温平衡30min备用；液体试剂用前混匀。2、配液：将浓缩洗涤液用蒸馏水或去离子水20倍稀释得到洗涤缓冲液；3、设定：2个阴性对照孔和2个阳性对照孔，其余为待测样本孔。4、待测标本预稀释：使用样品稀释液将待检样品血清、阴性对照血清、阳性对照血清按照1：20的比例稀释。5、加样：各孔分别按预先设定加100μl稀释的待测样本。加样过程时间跨度应尽量短。6、温育：震荡混匀，置37℃温箱中，反应30min。7、洗板：弃去反应液，每孔加300μl稀释后的洗涤缓冲液，浸泡15s，甩弃洗液，连续洗板4次后拍干。8、加酶：各孔加100μl辣根过氧化物酶标记兔抗猪IgG抗体。9、温育：置37℃温箱，反应30min。10、洗板：弃去反应液，每孔加入稀释后的洗涤缓冲液300μl，浸泡15s，甩弃洗涤液，连续洗板4次后拍干。11、显色每孔加入100μl底物工作液(将底物液A和底物液B等量混合即为底物工作液，现用现配)，震荡混匀，置37℃温箱中，避光反应15min。12、每孔加入显色终止液50μl，振荡混匀终止反应。13、测定每孔的OD450nm值(加终止液的反应板应在15min内读取OD450nm值)。检测结果的判定：1、阴性对照OD450nm平均值应该≤0.15，否则无效。2、阳性对照每个检测值应该在1.0～2.5之间，否则无效。3、临界值的计算：临界值＝0.18×阳性对照OD450nm值平均值。待检血清测定OD450nm值≥临界值者判为阳性；待检血清测定OD450nm值<临界值者判为阴性。本专利技术的上述试剂盒，可用于检测猪圆环病毒3型抗体，以判断被检动物是否存在感染后产生的猪圆环病毒3型抗体。在制备检测是否感染猪圆环病毒3型病的试剂盒中的应用也属于本专利技术的保护范围；本专利技术的积极效果在于：本专利技术采用生物信息学方法对猪圆环病毒3型Cap蛋白的抗原表位进行精确分析筛选出适合ELISA检测用的肽段。该肽段集中了抗原表位，具有灵敏性高、特异性强的优点。同时，采用先进的固相合成肽技术合成多肽抗原用于包被酶标反应板的制备。另外，由于试剂盒中使用的包被抗原是化学合成多肽，不含杂蛋白，纯度高，进一步提本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.猪圆环病毒3型抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。

【技术特征摘要】
1.猪圆环病毒3型抗原表位多肽，为序列表中序列1所示的多肽、序列表中序列2或序列表中序列3所示的多肽。2.权利要求1所述的猪圆环病毒3型抗原表位多肽在制备检测猪圆环病毒3型抗体的间接ELISA检测试剂盒中的应用。3.猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物，为序列表中序列2和序列表中序列3所示的多肽中的一种或两种以上的任意组合。4.根据权利要求1所述的猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物，其特征在于，当所述多肽为序列2和序列3所示的多肽中的两种时，两种多肽的质量比为(0.5～1.5)：(0.5～1.5)；优选的，它们的质量比为1：1。5.一种猪圆环病毒3型ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包含猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物作为抗原包被的酶联反应板、阳性对照血清、阴性对照血清和酶标二抗；所述猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物，为权利要求2或权利要求3所述的猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物。6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述酶联反应板的制备方法是将权利要求1或2所述的猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔150ng猪圆环病毒3型抗原表位多肽组合物...

【专利技术属性】
技术研发人员：董春娜，张蕾，李静，肖进，张文亮，向王震，张欣，齐鹏，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11