本发明专利技术提供本一种猫细小病毒VP2蛋白及制备的病毒样颗粒，其中VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2；其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:1。本发明专利技术再一个方面提供一种重组杆状病毒，其中包含有编码上述VP2蛋白的核苷酸片段；本发明专利技术所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备猫细小病毒的病毒样颗粒。本发明专利技术还提供一种猫细小病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本发明专利技术制备的病毒样颗粒。本发明专利技术制备的疫苗免疫猫后能提高猫的抗体滴度，能够有效预防猫细小病毒的感染。
A VP2 Protein of Feline Parvovirus and Virus-like Particles Prepared
【技术实现步骤摘要】
一种猫细小病毒VP2蛋白及制备的病毒样颗粒
本专利技术属于基因工程
，更具体地涉及一种猫细小病毒VP2蛋白，以及用昆虫细胞表达体系表达猫细小病毒的病毒样颗粒(VLP)；还涉及所获得的重组病毒样颗粒，及其在猫细小病毒疫苗研制中的应用。
技术介绍
猫泛白细小减少症是由猫细小病毒(Felinepanleukopeniavirus,FPV)引起的一种高度接触性急性传染病，具有很高的发病率和死亡率。患病动物表现为高热、呕吐、腹泻、白细胞数目严重减少和肠炎等症状。该病毒在自然条件下感染猫科和鼬科多种动物，如虎、豹、狮子和浣熊，但以体型较小的猫科动物，包括水貂最为易感。该病每年对动物养殖业带来重大经济损失。猫细小病毒属细小病毒科细小病毒属，为单股负链线性DNA病毒，无囊膜，对物理化学因素具有很强的抵抗力。FPV病毒基因组编码2种结构蛋白(VP1、VP2)和2种非结构蛋白(NS1、NS2)，其中VP2结构蛋白是病毒刺激机体产生保护性抗体的重要抗原蛋白。杆状病毒是一类大型的杆状囊膜病毒，基因组为环状双链DNA，大小约为80-180kbp。杆状病毒作为病原微生物寄生于节肢动物，具有高度的宿主特异性，其宿主主要有鳞翅目双翅目和膜翅目昆虫，尚未发现节肢动物以外的杆状病毒宿主。在杆状病毒的众多成员中，目前研究和利用最多的是苜蓿银纹夜蛾多粒包埋核型多角体病毒(AcMNPV)。AcMNPV病毒基因组为共价闭合环状超螺旋的双链DNA，约130kb,其基因组序列目前已测出。近年来，杆状病毒表达载体以自身的优势，已经在表达载体上占了主导的地位。杆状病毒表达系统与其他的表达系统相比，杆状病毒表达系统具有操作简单、安全性高，可容纳大的目的基因，表达外源蛋白效力高，有翻译后修饰的作用，表达蛋白的免疫原性、生物活性与天然的蛋白相似等优点(Andersonetal.,1995；Wangetal.,2001；Ribeiroetal.,2001)。目前市场上还没有应对FPV的特效药和有效的治疗办法，临床上以免疫预防为主，但是国内还没有真正批准上市的FPV疫苗。所以需要研制一种安全、有效的亚单位疫苗来填补市场的空白。
技术实现思路
本专利技术提供一种猫细小病毒VP2蛋白及制备的病毒样颗粒，从而弥补现有技术的不足。本专利技术首先提供一种猫细小病毒中筛选获得的新型的VP2蛋白，其氨基酸序列为SEQIDNO:2；本专利技术还对上述的VP2蛋白进行优化，优化后的蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4；编码上述VP2蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:3；本专利技术还提供一种重组杆状病毒，其中包含有编码VP2蛋白的核苷酸片段；本专利技术所构建的重组杆状病毒用于在昆虫细胞中制备猫细小病毒的病毒样颗粒；本专利技术再一个方面提供一种猫细小病毒的病毒样颗粒，是使用上述的重组杆状病毒感染昆虫细胞后，培养收集获得的。所述的昆虫细胞为昆虫细胞Sf9；本专利技术所制备的病毒样颗粒用于制备疫苗；本专利技术还提供一种猫细小病毒亚单位疫苗，包括有抗原和疫苗佐剂，其所用的抗原为本专利技术制备的病毒样颗粒；本专利技术制备的疫苗免疫猫后能提高猫的抗体滴度，预防猫细小病毒的感染。具体实施方式本专利技术对猫细小病毒的VP2的cDNA全序列分别进行筛选和分析，选取了其中一段抗原表位较丰富、能够在昆虫细胞中高效表达的cDNA序列，构建了杆粒载体，并在昆虫细胞中成功地表达出可溶性的重组蛋白，该蛋白在体内自动组装成病毒样颗粒(VLPS)，VLP在空间构想上更类似与天然病毒，可同时刺激机体产生细胞免疫和体液免疫，免疫效果好，且由于VLP不含有病毒核酸，不存在潜在的病毒致病基因，安全性更高。此外，利用昆虫细胞-杆状病毒表达系统制备的FPV-VLP产量显著高于猫肾细胞培养的病毒，生产成本明显降低。下面结合具体实施例对本专利技术进行详细的描述。本专利技术所应用的方法可以采用疫苗制备领域中常用的方法，而不仅限于本专利技术实施例的具体记载，本领域的普通技术人员可以其它常规方法来实现本专利技术。实施例1：VP2基因的扩增及序列分析2018年收集疑似猫细小病料进行处理，将病料进行常规分离、鉴定，判定为猫细小用猪红细胞进行HA检测，血凝价为7log2。用已知的猫细小血清进行HI试验，结果交叉反应差；证明致病的猫细小病毒株发生了突变。1、扩增猫细小VP2基因根据NCBI中发表的猫细小VP2基因序列，设计并合成了引物,引物的序列信息如下：primer1：5′-ATGAGTGATGGAGCAGTTCAACC-3′；primer2：5′-TTAATATAATTTTCTAGGTGCTAGTTG-3′。提取分离的猫细小核酸作为模板，用引物primer1和primer2进行PCR扩增目的片段，经序列测定，其核苷酸序列为SEQIDNO:1，编码的氨基酸序列为SEQIDNO:2。与NCBI中已公布的猫细小VP2蛋白(AAA47152.1)进行比对分析，发现多个位点发生了变异，其中第80位(K变S)，第87位(M变V)，第232位(I变V)，第267位的(F变C)，第564位(N变R)，第568位的(A变G)位点发生了变异。结果表明分离的毒株为新的细小病毒，含有新的VP2抗原蛋白。2、VP2基因的剪切、优化将分离毒株的结构蛋白基因VP2的抗原位点进行了分析，将其N端32aa删除，加入M氨基酸，C端9aa删除，同时将密码子进行优化；优化修饰后的序列为能很好地表达出抗原位点，且能自动组装成VLPS。优化修饰后的氨基酸序列为SEQIDNO:4；编码基因进行了密码子优化，消除基因稀有密码子，从而能够更好在杆状病毒表达系统中表达VP2蛋白；优化后的基因的核苷酸序列为SEQIDNO:3。实施例2、表达VP2基因的杆粒的构建2.1酶切反应2.1.1标记好需要用到的1.5mLEP管，在1.5mLEP管中按照下表进行加样、混匀：反应体系为50μL，加样如下表所示：2.1.2将步骤2.2.1中的1.5mLEP管置于37℃恒温水浴锅中，水浴2-3h。2.1.3双酶切产物胶回收取出上述双酶切体系，进行琼脂糖凝胶电泳以回收其中的DNA片段。(1)标记好样品收集EP管、吸附柱以及收集管。(2)称取标记好的空的EP管重量，并记录数值。(3)将单一的目的DNA条带在切胶仪上从琼脂糖凝胶中用手术刀小心切下放入干净的1.5mL离心管中。(4)向步骤(3)中的1.5mL离心管中加入600μLPCbuffer50℃水浴放置5min左右，其间不断温和上下翻转离心管，以确保胶块充分溶解。(5)柱平衡：向吸附柱CB2中(吸附柱预先放入收集管中)加入500μL平衡液BL，离心12,000rpm，1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。(6)将步骤(5)所得溶液加至吸附柱CB2中，静置2min，10,000rpm，离心30s，倒掉收集管中的废液，再将吸附柱CB2放入收集管中。(7)向吸附柱中加入600μL漂洗液PWbuffer，静置3min，离心10,000rpm，30s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱CB2放入收集管中。(8)重复步骤(7)。(9)空吸附柱离心，12,000rpm，2min，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于室温放置10min，彻底晾干。(10)将吸附柱CB2放入收集管中，向吸附膜中间位置悬空滴加50μL本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猫细小病毒VP2蛋白，其特征在于，所述的VP2蛋白的氨基酸序列为SEQ ID NO:2。
【技术特征摘要】
1.一种猫细小病毒VP2蛋白，其特征在于，所述的VP2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:2。2.如权利要求1所述的猫细小病毒VP2蛋白，其特征在于，所述的VP2蛋白的氨基酸序列为SEQIDNO:4。3.一种基因，其特征在于，所述的基因用于编码权利要求1或权利要求2所述的猫细小病毒VP2蛋白。4.如权利要求3所述的基因，其特征在于，用于编码权利要求1所述的猫细小病毒VP2蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:1。5.如权利要求3所述的基因，其特征在于，用于编码权利要求2所述的猫细小病毒VP2蛋白的基因，其核苷酸序列为SEQIDNO:3。6.一种重组杆状病毒，其特征...
【专利技术属性】
技术研发人员：郭伟伟，刘大卫，向银辉，陈俭梅，范根成，杜元钊，
申请(专利权)人：青岛易邦生物工程有限公司，
类型：发明
国别省市：山东,37
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