本发明专利技术涉及一种人类细小病毒基因工程人工表达抗原；制备该抗原的方法，该方法人工合成部分人类细小病毒VP2蛋白抗原基因序列，构建原核表达载体，大肠杆菌表达人类细小病毒VP2蛋白抗原，采用透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性包涵体，获得具有三维结构和免疫活性的重组人类细小病毒VP2蛋白抗原；一种人类细小病毒抗体快速检测方法，该方法包括应用人类细小病毒VP2蛋白抗原；一种用于人类细小病毒抗体检测的快速检测试剂盒，该试剂盒包含人类细小病毒VP2蛋白抗原，可直接用于全血检测。该试剂盒包含风湿因子处理垫，可以去除样品中的风湿因子，直接对样品中的IgM进行检测。根据本发明专利技术，提供了一种人类细小病毒抗原，该抗原具有高度的特异性。本发明专利技术提供了制备该抗原的方法，快速测定人类细小病毒抗体的方法，以及用于快速测定人类细小病毒抗体的试剂盒。
【技术实现步骤摘要】
本专利技术属于临床医学检测领域，涉及免疫层析检测技术，具体涉及一种用于诊断人类细小病毒感染的人类细小病毒抗原，制备该抗原的方法，用该抗原检测人类细小病毒的快速检测试剂盒。
技术介绍
人类细小病毒（HumanParvovirusB19,HPV）引起典型疾病是传染性红斑和急性关节病，一般感染者有自限性，可以自愈。但该病毒在一些血液病和免疫受损病人可引起再生障碍危象，在妊娠妇女可引起胎儿水肿乃至死胎。除了这些常见临床症状外，经常还会引起急性呼吸道炎等呼吸道感染症状。在大多数国家中，B19病毒感染通常发生在孩童，大约50%的儿童到15岁时才会具有抗B19抗体。在整个生命过程中，B19抗体可能会进一步增加，老年个体此值达到90%以上。B19病毒是DNA病毒中体积最小，结构简单的一种病毒，其DNA为单链，线状分子，病毒颗粒的直径为20~25nm，呈20面体立体对称，无囊膜，单个的病毒颗粒所含DNA为正链或负链DNA。此病毒在60℃孵育16h仍保持其感染性。其病毒基因组编码3种主要的蛋白，VP1、VP2和NS1。VP1（83kDa）、VP2(59kDa)是衣壳的结构蛋白。这两种蛋白分别在约第2444-4789位和约第3125-4789位核苷酸编码。VP2构成了衣壳的95%，VP1蛋白仅占衣壳的5%。在人类细小病毒的抗原中，VP2抗原是一种最佳候选抗原。VP2是人类细小病毒的主要结构蛋白之一，其保守性较好，抗原表位集中，是病毒主要的中和抗原决定簇所在的部位，也是激发机体产生保护性抗体最主要的病毒抗原，这使得VP2成为研制诊断试剂盒候选抗原的首选。在人细小病毒B19感染后7-10天后出现特异性的IgM抗体，IgM的升高会持续2-3个月。IgM抗体出现几天后可检测到IgG抗体，它将持续终生。人细小病毒B19不能用常规的细胞进行培养，使得该病毒的实验室检测和分离非常困难。因而多年来细小病毒的唯一抗原来源是病毒血症患者的血清。细小病毒一般通过呼吸道传播，也可经输血、血液制品以及血-胎途径传播。人细小病毒B19的直径小而且无包膜，灭活和去除工作非常困难，尤其是在高浓度时，细小病毒B19能抵抗血制品的常规热处理。病原微生物感染症的实验室检测主要包括对感染部位等处的病原菌的检测和对患者血清、体液中的抗体检测两种方法。目前，B19的检测方法分为血清学、分子生物学和组织学检测三大技术。其中，以ELISA为代表的血清学检查和以PCR为代表的分子生物学检测较为容易。但由于B19病毒不易体外培养，抗原制备也比较困难，导致B19的血清学检测难以普遍应用。而病毒颗粒电镜观察需要电镜设备，应用范围小，操作麻烦，另外观察点的选择可能会受人为因素干扰。并且，分子生物学检测中放射免疫法（RIA）、酶免疫法（EIA）、免疫荧光法（IF）、免疫印迹法（WB）和酶联免疫吸附法（ELISA）均需要有专业人员进行操作，需要设备进行判读，检测时间均较长，在临床应用，以及普及推广、现场检测等方面较难推广。目前，还没有一种能快速检测人类细小病毒便捷方法。因此，急需要一种快速方便快捷的方式去检测人类细小病毒的感染，利于细小病毒引起的传染的早期诊断。其次还可以用于血液制品的检测，提高血液制品的安全性。
技术实现思路
本专利技术的第一目的是提供一种工程表达人类细小病毒VP2蛋白特异性抗原，该抗原具有高度的特异性和免疫反应性。抗原具有免疫原性高，无特异反应，抗原表位集中等优点。本专利技术的第二目的是提供一种制备工程表达人类细小病毒VP2抗原的方法，该方法利用合成基因的原核表达，通过包涵体复性制备活性高的特异抗原，该方法制备的人类细小病毒抗原具有特异性和免疫反应性。本专利技术的第三目的是提供一种测定抗人类细小病毒抗体的试剂盒，该试剂盒为快速“一步检测法”试剂盒，具有灵敏度高、特异性强，检测速度快、操作简便，无需专门设备，适用于临床检测、流行病学调查、血液制品检测和场地检疫等多种场合。本专利技术的第四目的是提供一种人类细小病毒抗体全血快速检测装置，它装有抗红细胞抗体的滤膜，是一种可以过滤掉红细胞的人类细小病毒全血检测装置。本专利技术的第五目的是提供一种具有风湿因子处理垫的人类细小病毒快速检测装置，它是一种固定有抗风湿因子抗体的无纺布或者硝酸纤维素膜的IgM直接检测装置。本专利技术的主要内容(1)一种人类细小病毒抗原，它是一种采用基因工程技术人工制备的抗原。(2)一种制备人类细小病毒抗原的方法，包括人工合成优化的人类细小病毒VP2抗原基因序列，构建原核表达载体，大肠杆菌表达人类细小病毒VP2蛋白，采用透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性包涵体，获得具有三维结构和免疫活性的重组人类细小病毒VP2蛋白抗原。(3)一种人类细小病毒抗体快速检测方法，包括应用上面（1）中的人类细小病毒抗原。(4)上述（3）中人类细小病毒抗体快速检测方法，包括（1）中的人类细小病毒抗原固定到一种硝酸纤维素膜，一种标记抗体（二抗）固定到固相载体上，待测样品与标记抗体（二抗）接触，若待测样品中存在人类细小病毒抗体，则人类细小病毒抗体与标记二抗形成抗体-标记二抗复合物，“复合物”在硝酸纤维素膜水平移动，遇到固定到膜上的人类细小病毒抗原产生反应，带有标记的“复合物”就被特异地固定到抗原上，固定抗原的位置就会有显色反应；若待测样品不含人类细小病毒抗体，则“复合物”不能固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据硝酸纤维素膜固定抗原位置是否有显色反应，来判断检测结果，即待测样品中是否有人类细小病毒抗体。(5)上述（4）人类细小病毒抗体检测方法，其中待测样品是人的全血，血浆或血清。(6)上述（4）或（5）中测定人类细小病毒抗体的方法，其中的标记抗体（二抗）是标记的抗人IgM或抗人IgG抗体。(7)上述（4）-（6）中标记抗体是胶体金属颗粒或者彩色胶乳颗粒标记的抗体。(8)一种快速检测人类细小病毒抗体的试剂盒，它所用抗原为上述（1）中的人类细小病毒抗原。(9)上述（8）中用于快速检测人类细小病毒抗体的试剂盒，其中的标记抗体是胶体金属颗粒标记抗体或者彩色胶乳颗粒标记抗体。(10)上述（8）中用于检测的试剂盒，其中的滤血膜是固定有抗红细胞单抗或者多抗的无纺布。(11)上述（8）中用于检测的试剂盒，其中的风湿因子处理垫是固定有抗风湿因子单抗或者多抗的无纺布或者硝酸纤维素膜。下面对本专利技术进行详细阐述。本专利技术的人类细小病毒抗原，主要通过将人类细小病毒VP2蛋白基因构建到原核表达载体pET30a，pET30a-VP2表达载体转化大肠杆菌，筛选阳性重组菌，IPTG诱导重组菌表达人类细小病毒VP2蛋白，经细菌裂解、包涵体溶解和重组蛋白结构复性与纯化等步骤获得。下面将详述本专利技术制备人类细小病毒抗原的方法。从GenBank获取人类细小病毒VP2蛋白基因序列，根据人类细小病毒VP2蛋白基因人工合成人类细小病毒VP2蛋白优化的部分基因序列。目的基因经双酶切后与经同样双酶切过得原核表达载体连接，转化感受态细胞（大肠杆菌）、筛选阳性重组菌。阳性克隆菌提取质粒、双酶切和测序鉴定，证明插入的目的基因正确。重组菌经IPTG诱导表达、离心得重组菌沉淀，菌体重悬于缓冲液后超声裂解，离心获得包涵体形式的的蛋白沉淀，经洗涤后溶于尿素溶液中复性。变性蛋白需要经过结构复性与纯化才能获得本文档来自技高网...
【技术保护点】
一种小儿人类细小病毒B19（HPVB19）抗原，它是一种采用基因工程技术原核表达，透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性得到的大小为35.2 kDa的重组抗原。
【技术特征摘要】
1.一种小儿人类细小病毒B19（HPVB19）抗原，它是一种采用基因工程技术原核表达，透析法、梯度稀释法和凝胶层析法复性得到的大小为35.2kDa的重组抗原。2.根据权利要求1所述的抗原，它是人类细小病毒VP2蛋白部分序列进行人工合成的基因原核表达而来；所述抗原有表达稳定，表达量高，免疫原性高等优点。3.一种人类细小病毒抗体快速检测方法，包括应用权利要求1中任一权项的人类细小病毒抗原固定到硝酸纤维素膜，胶体金属颗粒或彩色胶乳颗粒标记抗体（二抗）接触，若待测样品中存在人类细小病毒抗体，则人类细小病毒抗体与标记二抗反应形成抗体-标记二抗复合物，“复合物”在硝酸纤维素膜水平移动，遇到固定到硝酸纤维素膜上的人类细小病毒抗原产生反应，带有标记的“复合物”就被特异地固定到抗原上，固定抗原的位置就会有显色反应，若待测样品不含人类细小病毒抗体，则“复合物”不能固定到抗原的位置上，此处就没有显色反应，可依据硝酸纤维...
【专利技术属性】
技术研发人员：李克生，杜惠芬，
申请(专利权)人：兰州雅华生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：甘肃;62
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