描述了具有与SEQ ID NO：3的序列具有至少98％同一性或与SEQ ID NO：4的序列至少94％同一性的氨基酸序列的AAV衣壳蛋白。还描述了一种药物组合物，包含该衣壳蛋白的AAV衣壳和病毒颗粒，包含编码该衣壳蛋白的核苷酸序列的重组AAV载体和包含该衣壳蛋白或该载体的宿主细胞和转基因动物。另外，还描述了将目的核酸转移到哺乳动物中的方法，其包括将重组AAV载体导入哺乳动物，其中该重组AAV载体包含被包裹到包含该衣壳蛋白的衣壳中的目的基因。
【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】衣壳专利
本专利技术涉及腺相关病毒(AAV)衣壳变体。专利技术背景近年来已经开发了基于不同病毒的多个重组基因转移载体。基于腺相关病毒(AAV)的基因转移载体、即AAV载体是优选的，因为它们能够转导不同类型的不同组织的分裂和非分裂细胞的能力，以及建立稳定的长期转基因表达的能力。虽然基于其他病毒例如腺病毒和逆转录病毒的载体可能具有某些期望的特征，但它们也与不期望的副作用相关。基于AAV的基因转移载体尚未检测到此类副作用(Mannoetal.,NatureMedicine,12(3):342(2006))。已经鉴定、克隆、测序并转化为载体的许多AAV血清型。这些血清型包括AAV8、AAV5、AAV3B和最近描述的AAV-LK03(WO2013/029030)。然而，本专利技术人已经发现许多目前使用的载体在人中具有低的转导率。例如，AAV8载体在人中的转导是小鼠中的二十分之一，以及发生在三分之二的高剂量组群中瞬时、泼尼松龙反应性转氨酶升高(transaminitis)。因此，需要新的AAV载体来提高效能和安全性，并且促进更广泛的临床适用性。为此，本专利技术人通过经验交换来自4种不同AAV衣壳的各种结构域已经开发了新的杂合衣壳：(1)AAV8，(2)AAV5，(3)AAV3B和(4)AAV-LK03。开发了与目前使用的载体相比达到至多5倍的基因转移水平的衣壳。专利技术概述在本专利技术的第一方面，提供了具有与SEQIDNO：3具有至少98％同一性或与SEQIDNO：4具有至少94％同一性的氨基酸序列的AAV衣壳蛋白。专利技术人已经出乎意料地发现，该新的衣壳蛋白产生提供比目前使用的AAV载体更高的转导率的衣壳。此外，已经发现，患者中针对该衣壳的抗体的流行率低于一些目前使用的AAV载体。在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO：4的序列具有至少95％的同一性。在具体实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO：4的序列具有至少96％的同一性。在进一步的实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO：4的序列具有至少97％的同一性。在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO：4的序列具有至少98％的同一性。在其它实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO：4的序列具有至少99％的同一性。在具体实施方案中，氨基酸序列具有SEQIDNO：4的序列。在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO：3的序列具有至少98.5％的同一性，优选与SEQIDNO：3的序列具有至少99％的同一性，更优选与SEQIDNO：3的序列具有至少99.5％的同一性。在具体实施方案中，氨基酸序列具有SEQIDNO：3的序列。在一些实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO：3的序列具有同一性。在其它实施方案中，氨基酸序列与SEQIDNO：4的序列具有同一性。在优选的实施方案中，氨基酸序列具有SEQIDNO：4的序列。更优选地，氨基酸序列具有SEQIDNO：3的序列。具有上述氨基酸序列的衣壳蛋白是功能性衣壳蛋白，其可以与其它必需的衣壳蛋白一起形成功能性衣壳。功能性衣壳是可以包围遗传物质，进入细胞并用遗传物质转导细胞的衣壳。确定衣壳是否功能正常在技术人员的能力范围内。例如，以下在本专利技术的详述中描述的实验可以用于确定衣壳是否可以成功转导细胞。通过克隆包含AAV3B衣壳的VP2和VP3结构域上游的AAV8VP1区的146个氨基酸区域来产生SEQIDNO：3。通过克隆AAV3BVP2和VP3区上游的AAV5VP1区产生SEQIDNO：4。以下提供AAV血清型和衣壳蛋白的进一步细节。本专利技术的第二方面提供了包含上述AAV衣壳蛋白的AAV衣壳。AAV衣壳是由VP1、VP2和VP3蛋白组成的蛋白质壳，其包裹(或包围)病毒的遗传物质。此外，提供了包含上述AAV衣壳蛋白的病毒颗粒。病毒颗粒包含AAV衣壳和病毒的遗传物质。在本专利技术的第三方面，提供了包含编码上述氨基酸序列的核苷酸序列的重组AAV(rAAV)载体。这意味着该载体含有编码功能性衣壳蛋白的核苷酸序列。优选地，该载体还包含启动子，使得核苷酸序列是可表达的。优选地，该载体包含AAV2p40病毒启动子，其在大多数哺乳动物细胞类型中是组成型活性的。因此，本专利技术提供了基于通常感染人(例如，血清型1、2、3A、3B、4、5和6)或灵长类动物(例如，血清型1和4)的腺相关病毒(AAV)的基因递送载体。关于这种病毒的进一步信息在KennethI.Berns,"Parvoviridae:TheVirusesandTheirReplication,"Chapter69于FieldsVirology(3dEd.1996)中有描述。所有已知AAV血清型的基因组组成非常相似。AAV的基因组是长度小于约5,000个核苷酸(nt)的线性单链DNA分子。末端反向重复序列(ITR)侧接编码非结构复制(Rep)蛋白和结构(VP)蛋白的独特核苷酸序列。VP蛋白(VP1、VP2和VP3)形成衣壳。末端145nt是自身互补的并且被组织成以便可以形成形成T形发夹的能量稳定的分子内的双链体。这些发夹结构作为病毒DNA复制的起点，用作细胞DNA聚合酶复合物的引物。在哺乳动物细胞中野生型(wt)AAV感染后，Rep基因(即编码Rep78和Rep52蛋白)分别由P5启动子和P19启动子表达，并且两个Rep蛋白在病毒基因组的复制中具有功能。RepORF中的剪接事件导致实际上四种Rep蛋白的表达(即Rep78、Rep68、Rep52和Rep40)。然而，已经显示在哺乳动物细胞中编码Rep78和Rep52蛋白的未剪接的mRNA足以产生AAV载体。在昆虫细胞中，Rep78和Rep52蛋白也足以产生AAV载体。在适合用作基因治疗载体的AAV中，载体基因组通常包含待包装的用于递送至靶细胞的目的核酸。根据该特定实施方案，核酸位于载体基因组任一端的病毒ITR之间。AAV基因组有可能仅使用一个ITR发挥功能。因此，在基于AAV的本专利技术的基因治疗载体中，载体基因组侧接至少一个ITR，但更典型地侧接两个AAVITR(通常具有载体基因组的任一侧，即5'末端一个和3'末端一个)。载体基因组中的核酸与ITR中的一个或多个之间可能存在插入序列。在本专利技术的上下文中，“至少一个ITR”被理解为是指包含大部分互补的、对称排列的序列也称为“A”、“B”和“C”区的回文序列。ITR起复制起点的作用，复制起点是在复制中具有“顺式”作用的位点，即作为反式作用复制蛋白例如Rep78(或Rep68)的识别位点，其识别回文和回文内的特定序列。ITR序列的对称性的一个例外是ITR的“D”区。它是独特的(在一个ITR内没有互补序列)。单链DNA的切口发生在A区和D区之间的交界处。这是新DNA合成开始的区域。D区通常位于回文的一侧，并为核酸复制步骤提供方向性。在哺乳动物细胞中复制的AAV通常具有两个ITR序列。然而，可以工程改造ITR，使得结合站点对称地位于A区和D区的两条链上，在回文的每一侧上有一个。在双链环状DNA模板(例如质粒)上，Rep78-或Rep68-辅助的核酸复制然后在两个方向上进行，单个ITR足以用于环状载体的细小病毒复制。因此，在本专利技术的上下文中可以使用一个ITR核苷酸序列。然而，优选地，使用两个或另一偶数个常规ITR。最优选地本文档来自技高网...
【技术保护点】
AAV衣壳蛋白，其具有与SEQ ID NO：3的序列具有至少98％同一性或与SEQ ID NO：4的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。
【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2015.05.11 GB 1508026.01.AAV衣壳蛋白，其具有与SEQIDNO：3的序列具有至少98％同一性或与SEQIDNO：4的序列具有至少94％同一性的氨基酸序列。2.权利要求1的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸序列与SEQIDNO：3的序列具有至少99％的同一性，或与SEQIDNO：4的序列具有至少97％的同一性。3.权利要求1或权利要求2的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸序列具有SEQIDNO：3的序列。4.权利要求1或权利要求2的AAV衣壳蛋白，其中所述氨基酸序列具有SEQIDNO：4的序列。5.AAV衣壳，其包含权利要求1至4...
【专利技术属性】
技术研发人员：A·纳斯瓦尼，A·戴恩，
申请(专利权)人：UCL商业有限公司，
类型：发明
国别省市：英国,GB
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