不同体积数字PCR定量分析方法技术

通过不同体积数字PCR的定量分析方法，可以获得的ln(c)相应的标准差σ以及置信区间。通过ln(c)相应的标准差σ以及置信区间可以得到待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c，因此也可以获知所述待测核酸扩增反应液中含有的DNA起始拷贝数目。所述不同体积数字PCR的定量分析方法可以利用少于200个微液滴实现5个数量级的检测动态范围，提高了数字PCR检测仪器的检测动态范围。并且，其性能可以和拥有12000个微液滴的单一体积数字PCR相媲美，节省了仪器的成本，耗材成本降低。

Quantitative Analysis of Different Volume Digital PCR

【技术实现步骤摘要】
不同体积数字PCR定量分析方法
本专利技术涉及数字PCR定量分析领域，特别是涉及一种不同体积数字PCR定量分析方法。
技术介绍
数字PCR(DigitalPCR，dPCR)是一种核酸分子绝对定量技术。相较于qPCR，数字PCR可让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。定量PCR是依靠标准曲线或参照基因来测定核酸量，而数字PCR则让你能够直接数出DNA分子的个数，是对起始样品的绝对定量。但是，目前数字PCR定量检测无论是微孔式还是液滴式的数字PCR技术，采用的都是是单一体积数字PCR技术。单一体积数字PCR的定量上限主要取决于反应单元的体积和数量，检测下限与样本总体积相关。单一体积数字PCR的定量分析方法需要连续对待测核酸扩增反应液进行稀释，增加了试剂的用量和交叉污染的风险，操作步骤繁琐。因此，单一体积数字PCR的定量分析方法缩小了数字PCR检测仪器的检测动态范围，从而无法提高检测灵敏度。
技术实现思路
基于此，有必要针对单一体积数字PCR的定量检测方法灵敏度低的问题，提供一种检测动态范围大的的不同体积数字PCR定量分析方法。本专利技术提供一种不同体积数字PCR的定量分析方法，包括：S4310：获取所有微液滴体积v1，v2，...vm，所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm；S4320：根据所有微液滴核酸扩增后的相关参数v1、v2，...vm，n1，n2，…，nm，b1，b2，…，bm，构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)；S4330：根据联合二项分布函数f(c)，求使得所述联合二项分布函数f(c)取极值时c的值；S4340：将所述联合二项分布函数f(c)转化为关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)，获得关于ln(c)的标准差以及置信区间；S4350：根据ln(c)的标准差以及置信区间，获取所述待测核酸扩增反应液浓度c的标准差以及置信区间。在其中一个实施例中，所述S4310包括：S4311：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，获得多个不同体积v1，v2，...vm的微液滴，所述微液滴体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm；S4313：将所有微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所述所有微液滴的荧光图像；S4315：根据所述所有微液滴的荧光图像，获取所述所有微液滴的体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。在其中一个实施例中，所述S4310还包括：S4312：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，形成多个微液滴；S4314：将所述多个微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所有微液滴核酸扩增后的荧光图像；S4316：根据所述荧光图像，获取所述所有微液滴核酸扩增后的体积，所述体积分别为v1，v2，...vm，所述体积分别为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。在其中一个实施例中，所述S4320构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)为：在其中一个实施例中，所述S4330包括：S4331：将所述联合二项分布函数f(c)求导，获取所述联合二项分布函数f(c)的导数；S4332：将所述联合二项分布函数f(c)的导数为0，获取所述联合二项分布函数f(c)取极值时的待测核酸扩增反应液浓度c的值。在其中一个实施例中，所述S4340中所述关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)为：在其中一个实施例中，所述S4340包括：S4341：将所述函数F(Λ)取对数，获取函数L(Λ)；S4342：对所述函数L(Λ)求一阶导数，并将函数L(Λ)的一阶导数为0；S4343：获取ln(c)相应的标准差σ；S4344：根据ln(c)相应的标准差σ，获取ln(c)的置信区间。在其中一个实施例中，所述S4343中根据ln(c)的Fisher信息量I(Λ)获取标准差σ。在其中一个实施例中，ln(c)的Fisher信息量I(Λ)为：在其中一个实施例中，所述ln(c)相应的标准差σ以及置信区间分别为：CI＝ln(c)±Zσ。通过不同体积数字PCR的定量分析方法，可以获得的ln(c)相应的标准差σ以及置信区间。通过ln(c)相应的标准差σ以及置信区间可以得到待测核酸扩增反应液的核酸浓度为c，因此也可以获知所述待测核酸扩增反应液中含有的DNA起始拷贝数目。所述不同体积数字PCR的定量分析方法可以利用少于200个微液滴实现5个数量级的检测动态范围，提高了数字PCR检测仪器的检测动态范围。并且，其性能可以和拥有12000个微液滴的单一体积数字PCR相媲美，节省了仪器的成本，耗材成本降低。附图说明图1为本专利技术提供的数字PCR检测仪的整体结构示意图；图2为本专利技术荧光检测装置结构示意图；图3为本专利技术数字PCR检测仪的分析方法流程图；图4为不同体积数字PCR的定量分析方法流程图。其中：10-微液滴生成装置；20-温控装置；30-荧光检测装置；310-第三控制器；330-荧光探测组件；331-相机；332-物镜；333-第二滤光片；340-激发光源；341-LED光源；342-准直镜；343-第一滤光片；344-二向色镜；345-复眼透镜；346-聚焦透镜；40-定量分析装置；50-控制器。具体实施方式为了使本专利技术的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下通过实施例，并结合附图，对本专利技术进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本专利技术，并不用于限定本专利技术。请参见图1，本专利技术提供一种数字PCR检测仪1，所述数字PCR检测仪1包括：微液滴生成装置10、温控装置20、荧光信号检测装置30、定量分析装置40以及控制器50。所述微液滴生成装置10用以将核酸扩增反应液微滴化，形成多个微液滴。所述温控装置20与所述微液滴生成装置10通过轨道连接，用以将所述多个微液滴转移至所述温控装置20，进行温度循环，实现核酸扩增。所述荧光信号检测装置30与所述温控装置20相对设置，用以对核酸扩增后的所述多个微液滴进行拍照检测。所述定量分析装置40与所述荧光信号检测装置30通过数据线连接，用以实现所述多个微液滴荧光信息的传输，进行定量分析。所述控制器50分别与所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、荧光信号检测装置30以及定量分析装置40连接，用以控制所述微液滴生成装置10、所述温控装置20、荧光信号检测装置30以及定量分析装置40。所述数字PCR检测仪1在工作时，所述微液滴生成装置10可以将所述待测核酸扩增反应液进行微滴化，从而形成多个微液滴。所述温控装置20可以对所述多个微液滴进行核酸扩增。所述荧光信号检测装置30实时拍测所述多个微液滴的荧光变化图片。通过所述多个微液滴的荧光变化图片。在一个实施例中，所述定量分析装置40为计算机。通过所述荧光信号检测装置30可以获得所述多个微液滴的荧光信息照片。所述计算机设置有分析软件，如matlab、microsoftoffice、origin以及Mi本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，包括：S4310：获取所有微液滴体积v1，v2，...vm，所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm；S4320：根据所有微液滴核酸扩增后的相关参数v1、v2，...vm，n1，n2，…，nm，b1，b2，…，bm，构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)；S4330：根据联合二项分布函数f(c)，求使得所述联合二项分布函数f(c)取极值时c的值；S4340：将所述联合二项分布函数f(c)转化为关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)，获得关于ln(c)的标准差以及置信区间；S4350：根据ln(c)的标准差以及置信区间，获取所述待测核酸扩增反应液浓度c的标准差以及置信区间。

【技术特征摘要】
1.一种不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，包括：S4310：获取所有微液滴体积v1，v2，...vm，所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm，以及所述体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm；S4320：根据所有微液滴核酸扩增后的相关参数v1、v2，...vm，n1，n2，…，nm，b1，b2，…，bm，构建关于待测核酸扩增反应液浓度c的联合二项分布函数f(c)；S4330：根据联合二项分布函数f(c)，求使得所述联合二项分布函数f(c)取极值时c的值；S4340：将所述联合二项分布函数f(c)转化为关于ln(c)的联合二项分布函数F(Λ)，获得关于ln(c)的标准差以及置信区间；S4350：根据ln(c)的标准差以及置信区间，获取所述待测核酸扩增反应液浓度c的标准差以及置信区间。2.如权利要求1所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述S4310包括：S4311：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，获得多个不同体积v1，v2，...vm的微液滴，所述微液滴体积为v1，v2，...vm依次对应的微液滴的数目n1，n2，…，nm；S4313：将所有微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所述所有微液滴的荧光图像；S4315：根据所述所有微液滴的荧光图像，获取所述所有微液滴的体积为v1，v2，...vm依次对应的核酸扩增后的阴性微液滴数目b1，b2，…，bm。3.如权利要求1所述的不同体积数字PCR的定量分析方法，其特征在于，所述S4310还包括：S4312：将含有目标核酸的样品溶液微滴化，形成多个微液滴；S4314：将所述多个微液滴进行核酸扩增，并拍照检测，获得所有微液滴核酸扩增后的荧光图像；S4316：根据所述荧光图像，获取...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛广济，
申请(专利权)人：思纳福北京医疗科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11