PCR反应增强剂组合物、微滴式数字PCR反应液及其应用制造技术

本发明专利技术提供一种PCR反应增强剂组合物，其包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P‑40中任意一种。本发明专利技术还提供一种微滴式数字PCR反应液，其特征在于，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P‑40中的任意一种；优选地，所述PCR反应液包含1～20mg/mL牛血清白蛋白、0.1～2mol/L海藻糖、0.02～1％w/v诺纳德P‑40。本发明专利技术还涉及包含所述PCR反应液的试剂盒以及利用所述PCR反应液进行微滴式数字PCR的方法。利用本发明专利技术提供的微滴式数字PCR反应液能提高阳性微滴PCR扩增效率，实现核酸靶分子精准定量分析。

Composition of PCR Reaction Enhancer, Micro-drop Digital PCR Reaction Solution and Its Application

【技术实现步骤摘要】
PCR反应增强剂组合物、微滴式数字PCR反应液及其应用
本专利技术属于分子生物学
，具体涉及一种微滴式数字PCR反应液及其应用。
技术介绍
微滴式数字PCR(dropletdigitalpolymerasechainreaction，ddPCR)技术是一种对核酸分子进行绝对定量的方法。相较于定量PCR(quantitativePCR,qPCR)，其在精密度、准确度和灵敏度方面具有无与伦比的优势；同时，ddPCR消除了对定量标准曲线的依赖，提高了对扩增抑制物的耐受能力；因此，ddPCR被称作第三代PCR技术。ddPCR的工作原理是在PCR扩增前对反应液进行微滴化处理，即将含有核酸模板的反应液分散成数万个纳升级的微滴，每个微滴不含或含有一至数个待检核酸靶分子，且每个微滴都作为一个独立的PCR反应单元。经PCR扩增后，含有待检核酸靶分子的微滴产生荧光信号，不含待检核酸靶分子的微滴不产生荧光信号。最终根据泊松分布原理以及阳性微滴的比例，计算出待检核酸靶分子的起始浓度或拷贝数。纳升级微滴是数字PCR的基本反应单元。微滴体积的减小增大了其比表面积，有助于PCR扩增过程中热量的快速传导。然而，纳升级微滴的界面效应显著增强，导致疏水的热启动DNA聚合酶如Taq酶倾向于吸附在油水界面(WilliamsR.etal.AmplificationofcomplexgenelibrariesbyemulsionPCR.Naturemethods,2006,3(7):545-550)。热启动DNA聚合酶的界面吸附作用降低了微滴式数字PCR的扩增效率，导致含有待检核酸靶分子的微滴不产生荧光信号，使核酸靶分子的绝对定量出现错误，因此需要一种优化的PCR反应液，消除热启动DNA聚合酶在油水界面的吸附作用。
技术实现思路
为解决上述DNA聚合酶在油水界面的吸附问题，本专利技术提供如下技术方案：本专利技术提供一种PCR反应增强剂组合物，其包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种。优选地，本专利技术的PCR反应增强剂组合物，其包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。较优选地，本专利技术的PCR反应增强剂组合物，其由牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40构成。本专利技术还提供一种微滴式数字PCR反应液，其中，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种。优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液中的PCR反应增强剂组合物包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其包含1～20mg/mL牛血清白蛋白。较优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其包含1～10mg/mL牛血清白蛋白。进一步优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其包含4～10mg/mL牛血清白蛋白。优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其包含0.1～2mol/L海藻糖。较优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其包含0.1～1mol/L海藻糖。进一步优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其包含0.2～0.8mol/L海藻糖。优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其包含0.02～1％w/v诺纳德P-40。较优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其包含0.02～0.5％w/v诺纳德P-40。进一步优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其包含0.05～0.3％w/v诺纳德P-40。优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其还包含Tris-HCl、KCl、MgCl2、dNTP和热启动DNA聚合酶。优选地，本专利技术的微滴式数字PCR反应液，其还包含10～50mMTris-HCl、25～100mMKCl、1.5～4mMMgCl2、0.2～0.4mMdNTP和0.02～0.05U/μL热启动DNA聚合酶。本专利技术还提供一种微滴式数字PCR试剂盒，其中，其包含上述任一种微滴式数字PCR反应液。本专利技术还提供一种使用前述任一种微滴式数字PCR反应液的微滴式数字PCR方法。在本专利技术中，对于牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40的来源没有具体限定，可以使用本领域技术人员熟知的可以使用的任何相关物质。专利技术的效果本专利技术优化了微滴式数字PCR实验的反应液，特别是在PCR反应液中加入PCR反应增强剂组合物，其中，牛血清白蛋白和诺纳德P-40可以竞争性的聚集在油水界面，从而减少热启动DNA聚合酶的界面吸附作用；牛血清白蛋白能提高PCR反应的扩增效率并减少体系中PCR抑制物对反应的影响；诺纳德P-40能减少非特异性扩增；海藻糖能提高DNA聚合酶热稳定性、降低DNA模板解链温度，减少G-C丰富区由于自身互补配对所形成的二级结构，因此提高PCR反应的特异性。从而解决了数字PCR微滴中热启动DNA聚合酶在油水界面吸附的问题，从而提高了微滴式数字PCR的扩增效率，促进了核酸靶分子的精准定量分析。附图说明图1(a)～(c)为本专利技术实施例13中的PCR反应液用于检测梯度稀释的酵母菌基因组DNA的微滴式数字PCR反应后的荧光图像(分别地，实际DNA浓度为2000copies/μL、200copies/μL、20copies/μL)。图2(a)～(c)为对比例6中的PCR反应液用于检测梯度稀释的酵母菌基因组DNA的微滴式数字PCR反应后的荧光图像(分别地，实际DNA浓度为2000copies/μL、200copies/μL、20copies/μL)。具体实施方式下面将参照附图更详细地描述本专利技术的具体实施例。虽然附图中显示了本专利技术的具体实施例，然而应当理解，可以以各种形式实现本专利技术而不应被这里阐述的实施例所限制。相反，提供这些实施例是为了能够更透彻地理解本专利技术，并且能够将本专利技术的范围完整的传达给本领域的技术人员。尽管本文使用了特定的术语，但它们仅用于一般性和描述性的意义，而不是为了限制的目的。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开描述的主题所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。使用标准命名法来描述化合物。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本专利技术所属领域的技术人员通常理解的相同的含义。本专利技术中的术语本专利技术中，微滴式数字PCR反应液是指包含KCl、Tris-HCl、dNTP、MgCl2、热启动DNA聚合酶和PCR反应增强剂组合物等组分的PCR反应体系。本专利技术中，数字PCR微滴是指将PCR反应液分散后的独立反应单元，其体积可微量化至数皮升，其数量可高达数百万个。本专利技术中，荧光探针是一种寡核苷酸探针，其5’末端标记荧光基团，如FAM、TET、VIC、HEX等，其3’末端标记淬灭基团，如TAMRA、BHQ等。PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，探针完整时，荧光基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，热启动DNA聚合酶的5'-3'外切酶活性将荧光探针酶切降解，使荧光基团和淬灭基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物的完全同步。本专利技术中，dNTP是脱氧核糖核苷三磷酸的缩写，是包括dATP，dGTP，dTTP，dCTP等在内的统称，N是指含氮碱基，代表变量指代A、T、G、C、U等中的一种。dNTP本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种PCR反应增强剂组合物，其包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P‑40中任意一种。

【技术特征摘要】
1.一种PCR反应增强剂组合物，其包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种。2.根据权利要求1所述的PCR反应增强剂组合物，其包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40，优选由牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40构成。3.一种微滴式数字PCR反应液，其中，其包含PCR反应增强剂组合物，所述PCR反应增强剂组合物包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40中任意一种，优选所述PCR反应增强剂组合物包含牛血清白蛋白、海藻糖和诺纳德P-40。4.根据权利要求3所述的微滴式数字PCR反应液，其中，所述PCR反应液包含1～20mg/mL牛血清白蛋白，优选所述PCR反应液包含1～10mg/mL牛血清白蛋白。5.根据权利要求3或4所述的微滴式数字PCR反应液，其中，所述PCR反应液包含0.1～2mol/L海藻糖，优选所述PCR反应液包含0...

【专利技术属性】
技术研发人员：马竣，翁蓉蓉，
申请(专利权)人：北京达微生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11