艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组及试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组及其试剂盒，所述引物组由TcdA引物、TcdB引物和GS引物组成；TcdA引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的TcdA上游引物、TcdA下游引物和TcdA探针；TcdB引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的TcdB上游引物、TcdB下游引物和TcdB探针；GS引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的GS上游引物、GS下游引物和GS探针；TcdA探针、TcdB探针和GS探针核苷酸序列的5’端均与荧光基团连接，3’端均与猝灭基团连接，并且TcdA探针、TcdB探针和GS探针三者的5’端分别连接不同的荧光基团。

Primers and kits for detection of Clostridium difficile by fluorescence quantitative PCR

【技术实现步骤摘要】
艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组及试剂盒
本专利技术微生物领域，特别是一种用于艰难梭菌荧光定量PCR检测的引物组及试剂盒。
技术介绍
艰难梭菌(Clostridiumdifficile)又称难辨梭菌、难辨棱状芽孢杆菌或困难梭菌，属厌氧性细菌，目前已被公认为是引起抗生素相关性腹泻(AAD)和伪膜性肠炎(PMC)的重要致病菌。除上述疾病外，艰难梭菌尚可引起肾盂肾炎、脑膜炎、腹腔及阴道感染、菌血症和气性坏疽等，近年来该菌已成为医院内感染的病原菌之一。引起临床症状的产毒艰难梭菌，产毒素种类包括毒素A(tcdA)、毒素B(tcdB)和二元毒素(cdtA/cdtB)，其中基础的毒素因子是毒素A和毒素B。目前国内临床诊断艰难梭菌毒素主要采用酶联免疫吸附(ELISA)检测毒素B，或者对疑似样本进行厌氧培养后鉴定，该方法检测时间长，操作比较繁琐，而且检测通量小，不适宜大规模的筛查。此外，由于检测的样本为粪便，含有较多干扰物质，容易造成假阴性等，影响检测的准确性。而针对疑似样本的厌氧培养鉴定的操作更加繁琐，须具备完善的实验条件和对检测的实验水平要求较高，同样不适宜大规模筛查。荧光定量PCR法检测病原体的应用因其快速、灵敏等优点越来越受医院检验科关注，相应的产品也正迅速更新换代，替代原有的不合时宜的检测方法。福建医科大学硕士论文“多重PCR方法检测艰难梭菌毒素A基因、毒素b基因和二元毒素基因，潘少敏”公开了一种利用PCR检测艰难梭菌的方法并公开了相关的引物，该文献使用的是普通PCR的方法，需要进行琼脂糖凝胶电泳和紫外凝胶成像分析仪下拍照分析，耗费时间，操作繁杂，而且琼脂糖凝胶电泳常用到核酸染色试剂溴化乙锭(EB)是强诱变剂，具有潜在的致癌风险，影响操作者健康；目前针对艰难梭菌运用荧光定量PCR法检测的引物及试剂盒尚未见报道。
技术实现思路
本专利技术所要解决的技术问题在于克服现有技术缺陷，提供一种根据目标序列设计特异性的引物组，将产毒素的艰难梭菌DNA目的片段进行扩增，通过多重荧光定量PCR检测艰难梭菌毒素A(tcdA)和毒素B(tcdB)的检测引物组及试剂盒。为实现上述目的，本专利技术通过以下技术方案实现：本专利技术首先提供了一种艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组，所述引物组包括TcdA引物、TcdB引物和GS引物；所述TcdA引物包括核苷酸序列依次如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的TcdA上游引物、TcdA下游引物和TcdA探针；所述TcdB引物包括核苷酸序列依次如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的TcdB上游引物、TcdB下游引物和TcdB探针；所述GS引物包括核苷酸序列依次如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示的GS上游引物、GS下游引物和GS探针；所述TcdA探针、TcdB探针和GS探针核苷酸序列的5’端均与荧光基团连接，3’端均与猝灭基团连接，并且TcdA探针、TcdB探针和GS探针三者的5’端分别连接不同的荧光基团；上述荧光基团与猝灭基团均为本领域常规的荧光染料基团，所述荧光基团包括但不限于FAM、VIC、ROX、CY5、JOE等基团，猝灭基团包括但不限于TRAMA、BHQ1、BHQ2等基团。进一步，本专利技术提供的艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组中，所述TcdA探针的5’端和3’端分别连接FAM基团和BHQ1基团；所述TcdB探针的5’端和3’端分别连接ROX基团和BHQ2基团；所述GS探针的5’端和3’端分别连接JOE基团和BHQ1基团。其次，本专利技术还提供了一种用于检测艰难梭菌的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中含有如权利要求1或2所述的引物组。进一步，本专利技术提供的用于检测艰难梭菌的试剂盒，包括：TcdA上游引物、TcdA下游引物、TcdA探针、TcdB上游引物、TcdB下游引物、TcdB探针、GS上游引物、GS下游引物、GS探针。第三，本专利技术还提供了一种荧光定量检测艰难梭菌的方法，其具体步骤如下：1)提取样本DNA根据本领域常规分别DNA提取方法或者选择市面上产品“粪便DNA基因组提取试剂盒”按说明书操作进行样本粪便的DNA提取。2)配制三种引物及探针表1三种引物及探针TcdA上游引物AGATTCCTATATTTACATGACAATATTcdA下游引物GTATCAGGCATAAAGTAATATACTTTTcdA探针FAM-AGATATTACTTCGAGCCTAATACAGC-BHQ1TcdB上游引物GGAAAAGAGAATGGTTTTATTAATcdB下游引物ATCTTTAGTTATAACTTTGACATCTTTTcdB探针ROX-CTGATGTAGTTCTTATAAGTAA-BHQ2GS上游引物GATCCCGATAGGCTCCACCACTTTGS下游引物ATCCACCGTGCGCCCTTTCTAGCTGS探针JOE-ACCGGAAAAGCGGAGGCGAGTGTT-BHQ1表1中探针分别由三种不同检测通道的荧光染料标记，并且选择合适的荧光基团和淬灭基团组合。表1中GS(内参)引物及探针要是在进行核酸提取时，加入的外源性DNA片段，用于评价核酸提取试剂盒操作是否出现异常。3)试剂准备按原料供应商荧光定量PCR(探针法)试剂盒说明书配制PCR反应缓冲液，(配置前将所有试剂涡旋后4000rpm离心10s处理)；表2PCR反应预混液配表试剂体积PCRBuffer35μLPrimerMix4.7μLDNATaq聚合酶0.3μL总体积40.0μL表2中，PrimerMix包括：浓度为10μM的TcdA上游引物0.6μL、浓度为10μM的TcdA下游引物0.6μL、浓度为10μM的TcdB上游引物0.6μL、浓度为10μM的TcdB下游引物0.6μL、浓度为10μM的GS上游引物0.6μL、浓度为10μM的GS下游引物0.6μL、浓度为10μM的TcdA探针0.4μL、浓度为10μM的TcdB探针0.4μL、浓度为10μM的GS探针0.4μL。4)荧光PCR扩增检测将步骤1)获得粪便样本DNA10μL(浓度约为0.1ng/μL)分别加至装有PCR预混液的PCR反应管中，涡旋混匀后4000rpm离心10s。将PCR反应管放入荧光PCR扩增仪中进行扩增检测；PCR扩增程序如下：95℃处理3min；95℃10s，55℃30s，72℃30s(收集荧光信号)，40个循环；仪器通道选择：毒素A-FAM通道；毒素B-ROX通道；内参-JOE通道(无ROX荧光染料校正)。运行上述程序，扩增完成后，若出现“s”型对数增长期扩增曲线，则认为样本含有毒素A或者毒素B(阳性)，反之，则判断样品不含毒素A或者毒素B(阴性)。本申请中，阳性样本是指含有毒素A或者毒素B的粪便样本，阴性样本是指不含毒素A或者毒素B的粪便样本。与现有检测方法相比，本专利技术提供了是荧光定量PCR的方法(Taqman探针法)鉴定引物组和试剂盒，即可以直接获得检测结果，还可以通过标准曲线进行定量分析，快速、准确、灵敏度高，易于推广应用。附图说明图1为阳性样本荧光定量PCR扩增曲线；图2为阴性样本荧光定量PCR扩增曲线；图3为毒素A灵敏度试验荧光定量PCR扩增曲线；图4为毒素B灵敏度试验荧光定量PCR本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组，所述引物组由TcdA引物、TcdB引物和GS引物组成；所述TcdA引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的TcdA上游引物、TcdA下游引物和TcdA探针；所述TcdB引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的TcdB上游引物、TcdB下游引物和TcdB探针；所述GS引物包括核苷酸序列依次如SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8和SEQ ID NO.9所示的GS上游引物、GS下游引物和GS探针；所述TcdA探针、TcdB探针和GS探针核苷酸序列的5’端均与荧光基团连接，所述TcdA探针、TcdB探针和GS探针核苷酸序列的3’端均与猝灭基团连接，并且TcdA探针、TcdB探针和GS探针三者的5’端所连接的的荧光基团均不相同。

【技术特征摘要】
1.一种艰难梭菌荧光定量PCR检测引物组，所述引物组由TcdA引物、TcdB引物和GS引物组成；所述TcdA引物包括核苷酸序列依次如SEQIDNO.1、SEQIDNO.2和SEQIDNO.3所示的TcdA上游引物、TcdA下游引物和TcdA探针；所述TcdB引物包括核苷酸序列依次如SEQIDNO.4、SEQIDNO.5和SEQIDNO.6所示的TcdB上游引物、TcdB下游引物和TcdB探针；所述GS引物包括核苷酸序列依次如SEQIDNO.7、SEQIDNO.8和SEQIDNO.9所示的GS上游引物、GS下游引物和GS探针；所述TcdA探针、TcdB探针和GS探针核苷酸序列的5’端均与荧光基团连接，所述TcdA探针、TcdB探针和GS探针核苷...

【专利技术属性】
技术研发人员：李刚，张娜，
申请(专利权)人：江苏佰思瑞生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32