琼脂糖酶基因、重组质粒、重组菌株、琼脂糖酶及其应用制造技术

本发明专利技术公开一种琼脂糖酶基因、重组质粒、重组菌株、琼脂糖酶及其应用，涉及基因工程技术领域。所述琼脂糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；所述琼脂糖酶基因caAgaA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；所述重组质粒携带所述琼脂糖酶基因caAgaA；所述重组菌株包含所述琼脂糖酶基因caAgaA。本发明专利技术提供的琼脂糖酶具有较好的热稳定性和pH稳定性，可用于新琼寡糖的制备以及琼脂糖凝胶后的核酸回收。

Agarose gene, recombinant plasmid, recombinant strain, agarose and its application

【技术实现步骤摘要】
琼脂糖酶基因、重组质粒、重组菌株、琼脂糖酶及其应用
本专利技术涉及基因工程
，特别涉及一种琼脂糖酶基因、重组质粒、重组菌株、琼脂糖酶及其应用。
技术介绍
琼脂是一种来源于红藻细胞壁中的杂多糖，主要由由琼脂糖和琼脂胶两种多糖组成。琼脂或者琼脂糖经琼脂糖酶水解可以得到具有生物活性的寡糖物质，利用琼脂糖酶的这一特性，琼脂糖酶在工业生产中和生物学研究中均具有重要的应用价值。然而，在工业生产以及生物学研究中，往往存在以下问题：琼脂糖酶往往对固体底物活性很差，但琼脂糖液化温度却高于60℃；颗粒状酶功效更佳，但酶产品在颗粒化时需要经历80℃高温过程；此外，在工业化生产时pH环境也会随着工艺条件发生变化，但目前已有的琼脂糖酶对高温以及酸碱性环境的适应性均较差，并不能适应上述应用场景，这极大地限制了琼脂糖酶的应用和发展，因此，需要发掘出具有良好的热稳定性和pH稳定性的琼脂糖酶。
技术实现思路
本专利技术的主要目的是提出一种琼脂糖酶基因、重组质粒、重组菌株、琼脂糖酶及其应用，旨在提供一种琼脂糖酶，该琼脂糖酶具有较好的热稳定性和pH稳定性。为实现上述目的，本专利技术提出一种琼脂糖酶，所述琼脂糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。本专利技术还提出一种琼脂糖酶基因caAgaA，用于编码上述琼脂糖酶，所述琼脂糖酶基因caAgaA的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。本专利技术还提出了一种重组质粒，携带权利要求2所述的琼脂糖酶基因caAgaA。优选地，所述重组质粒包含表达载体pET-28a。本专利技术还提出了一种重组菌株，包含上述的琼脂糖酶基因caAgaA。优选地，所述重组菌株由包含上述的琼脂糖酶基因caAgaA的重组质粒转化大肠杆菌BL21(Rosetta)获得。此外，本专利技术还提出了上述的琼脂糖酶在新琼寡糖的制备中的应用。以及，本专利技术还提出了上述的琼脂糖酶在琼脂糖凝胶电泳后的核酸回收中的应用。本专利技术技术方案中，提供了琼脂糖酶基因caAgaA、携带该基因的重组质粒以及重组菌株，该琼脂糖酶基因caAgaA可以编码出一种琼脂糖酶，所述琼脂糖酶不仅具有较高的催化活性，可有效地将琼脂或琼脂糖水解为4和6个残基的新琼寡糖，从而可用于生物活性新琼寡糖的制备，而且具有极佳的热稳定性和pH稳定性，从而拓展了琼脂糖酶的应用场景，降低了其应用时的工艺难度，减少了投入成本，因此，本专利技术提供的琼脂糖酶在工业生产中具有更强的适用性。附图说明为了更清楚地说明本专利技术实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅为本专利技术的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。图1为本专利技术提供的琼脂糖酶的SDS-PAGE测试结果图；图2为本专利技术提供的琼脂糖酶在不同pH值下的酶活测定结果图；图3本专利技术提供的琼脂糖酶在不同pH值下的稳定性测试结果图；图4为本专利技术提供的琼脂糖酶在不同温度下的酶活测定结果图；图5为本专利技术提供的琼脂糖酶在不同温度下的稳定性测试结果图；图6为本专利技术提供的琼脂糖酶在不同金属离子环境中的酶活测定结果图；图7为本专利技术提供的琼脂糖酶水解琼脂糖的薄层层析测试结果图；图8为本专利技术提供的琼脂糖酶在琼脂糖凝胶电泳后的核酸回收的测试结果图。本专利技术目的的实现、功能特点及优点将结合实施例，参照附图做进一步说明。具体实施方式为使本专利技术实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本专利技术实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。在工业生产以及生物学研究中，往往存在以下问题：琼脂糖酶往往对固体底物活性很差，但琼脂糖液化温度却高于60℃；颗粒状酶功效更佳，但酶产品在颗粒化时需要经历80℃高温过程；此外，在工业化生产时pH环境也会随着工艺条件发生变化，但目前已有的琼脂糖酶对高温以及酸碱性环境的适应性均较差，并不能适应上述应用场景，这极大地限制了琼脂糖酶的应用和发展。鉴于此，本专利技术提出了一种琼脂糖酶，所述琼脂糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。该琼脂糖酶含有310个氨基酸残基，理论分子量为35496.89道尔顿，等电点为4.42。其序列如SEQIDNO：2所示，与现有报道中的同糖苷水解酶家族(GH16)的琼脂糖酶的氨基酸序列(NCBI登录号为：AAF21821.1、AXY54922.1、ATG22743.1ALO78721.1、ATI96843.1、AXK59832.1、WP_066965750.1、ABW77762.1ANT83229.1、BAQ95400.1、AGU13985.1、AIF29515.1、AGW43026.1AFR90184.1、ACM50513.1、ADD60418.1、AAN39119.2、BAF34350.1ABL06969.1、AAF21820.1、BAD29947.1、BAC99022.1)的一致性较低，约为20～63％，也就是说，这是一种全新的琼脂糖酶。专利技术人发现，该琼脂糖酶为内切型：可以将琼脂糖水解为4个和6个残基的新琼寡糖，而不是水解成为二糖(即新琼二糖)；且最适反应温度为40℃，最适反应pH为7.0。同时，其生化特征还表现为：Zn2+和还原性试剂(二硫苏糖醇，DTT)在5mM的浓度下对琼脂糖酶caAgaA具有明显的激活效果。具体表现为：在DTT浓度为5mM的条件下，琼脂糖酶caAgaA表现出的活性是没有DTT条件下酶活的2.1倍；在Zn2+浓度为5mM的条件下，琼脂糖酶caAgaA表现出约165％的酶活。此外，该琼脂糖酶在70℃温度下孵育2h后仍然能够保持约80％的酶活，在pH为3～11条件下孵育2h后仍然能够维持大于40％的酶活，即本专利技术提供的琼脂糖酶具有极好的热稳定性和pH稳定性，也就是说，本专利技术提供的琼脂糖酶对温度和pH条件的要求更低，它可以适用于更多的应用场景，因此，在工业生产中具有更强的适用性。为此，本专利技术提出一种琼脂糖酶基因caAgaA，用于编码上述琼脂糖酶，所述琼脂糖酶基因caAgaA的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。专利技术人发现，来源于深海微生物Cellulophagaalgicola的琼脂糖酶编码基因序列可预测编码的蛋白质具有极好的热稳定性和pH稳定性，基于这种原因，并且为了适应具有不同密码子偏好的工程菌以实现琼脂糖酶的大量表达，专利技术人对这种来源于深海微生物Cellulophagaalgicola的琼脂糖酶编码基因序列进行设计，对琼脂糖酶编码基因序列进行了密码子优化，最终获得核苷酸序列如SEQIDNO：1所示的琼脂糖酶基因caAgaA。对该基因重组表达可以获得如上所述的琼脂糖酶，该琼脂糖酶具有较高的催化活性和生物学活性，且经功能鉴定后，证实其为内切型、具有上述生化特征、且具有耐高温及pH耐受范围宽泛的优势。具体地，本专利技术提供的琼脂糖酶基因caAgaA在GenBank基因数据库中通过对比搜索(PHI-BLAST，为美国国立生物信息研究中心开发的免费序列相似性搜索程序，网址为：https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)找到一种来源于本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种琼脂糖酶，其特征在于，所述琼脂糖酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

【技术特征摘要】
1.一种琼脂糖酶，其特征在于，所述琼脂糖酶的氨基酸序列如SEQIDNO：2所示。2.一种琼脂糖酶基因caAgaA，用于编码权利要求1所述的琼脂糖酶，其特征在于，所述琼脂糖酶基因caAgaA的核苷酸序列如SEQIDNO：1所示。3.一种重组质粒，其特征在于，携带权利要求2所述的琼脂糖酶基因caAgaA。4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，包含表达载体...

【专利技术属性】
技术研发人员：韩正刚，杨江科，张玉茜，
申请(专利权)人：武汉轻工大学，中国大洋矿产资源研究开发协会中国大洋事务管理局，
类型：发明
国别省市：湖北,42