一种蛋清中溶菌酶和卵转铁蛋白的联合分离方法技术

本发明专利技术公开了一种蛋清中溶菌酶和卵转铁蛋白的联合分离方法，属于蛋白质分离纯化技术领域，本发明专利技术方法包括(1)蛋清液调节pH至6.5‑9.5，采用金属螯合阳离子树脂吸附溶菌酶和卵转铁蛋白；(2)将洗脱液进行结晶处理得到溶菌酶晶体；(3)收集结晶后的上清液，采用阴离子交换树脂吸附，将洗脱液进行超滤和干燥处理，得到卵转铁蛋白。本发明专利技术方法可同时实现蛋清中溶菌酶和卵转铁蛋白的高效分离，得率均达75％以上、纯度均可达95％以上，并且所使用的方法具有操作简单、成本低的优势，易于产业化应用。

A Combined Method for Isolation of Lysozyme and Ovarian Transferrin from Egg White

【技术实现步骤摘要】
一种蛋清中溶菌酶和卵转铁蛋白的联合分离方法
本专利技术涉及一种蛋清中溶菌酶和卵转铁蛋白的联合分离方法，属于蛋白质分离纯化

技术介绍
蛋清蛋白质是食物中最理想的优质蛋白质，主要是由卵白蛋白、卵转铁蛋白、卵粘蛋白和溶菌酶组成。其中溶菌酶和卵转铁蛋白是备受科研人员关注的生物活性蛋白，具有巨大的应用潜力。溶菌酶是婴儿生长发育必不可少的抗菌蛋白，它既可杀死肠道腐败球菌，又能增强免疫球蛋白的免疫功能，提高婴儿的抗感染能力，特别是对早产婴儿有防止体重减轻、预防消化器官疾病、增进体重等功效，是婴儿功能食品的良好辅料。卵转铁蛋白同样是一种易溶的非结晶糖蛋白，其分子结构子区域之间通过反向平行的β链相连接，这一结构可以通过铰链机制展开和闭合，有利于与三价铁离子的结合。卵转铁蛋白通过与三价铁离子的结合而剥夺了诸多细菌生长繁殖所必须的三价铁离子，从而达到抑制细菌生长繁殖的目的，其具有广谱抑菌性，对假单胞菌、大肠杆菌以及沙门氏菌均有较强的抑制效果。卵转铁蛋白的抗菌性在数量与质量上与人类的乳铁蛋白相似，而抗病毒的性能甚至优于乳铁蛋白和血清转铁蛋白，另外卵转铁蛋白还表现出优异的抗氧化和抗癌活性。但是目前关于溶菌酶和卵转铁蛋白的分离方法普遍具有分离效率低且难以产业化的问题，因此，开发一种简便、有效分离蛋清中溶菌酶和卵转铁蛋白的方法是有迫切的市场需求的。
技术实现思路
为了解决上诉问题，本专利技术提出了金属螯合阳离子交换树脂吸附-结晶-阴离子交换树脂吸附方法，能同时得到高纯度的溶菌酶和卵转铁蛋白，操作方法简单易于产业化，能实现资源有效利用，推进蛋品企业附加值的提升。本专利技术的第一个目的是提供一种蛋清中蛋白质分离的方法，所述方法包括如下步骤：(1)调节蛋清液pH至6.5-9.5，然后加入阳离子交换树脂和三价铁源进行吸附分离；其中三价铁源中的铁离子相对蛋清液的摩尔浓度为0.05-0.4mmol/L；(2)洗脱树脂，得到洗脱液A；调节洗脱液A的pH，浓缩、结晶，得到溶菌酶结晶和清液B；(3)调节清液B的pH，提纯浓缩得到卵转铁蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中所述阳离子交换树脂包括羧基型弱阳离子交换树脂。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中所述三价铁源包括氯化铁、硫酸铁、硝酸铁等可溶性三价铁盐。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中树脂与蛋清液的质量比为1：(2-5)。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(1)中树脂与蛋清液的质量比优选1：3。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)洗脱树脂前还包括清洗树脂，所述清洗是利用料液比1：(2-5)的NaCl水溶液进行清洗，其中NaCl水溶液的质量浓度为0.5％-0.9％。在本专利技术的一种实施方式中，所述洗脱树脂是利用料液比1：(2-5)的NaCl溶液进行洗脱，其中NaCl溶液的质量浓度为4％-7％。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述洗脱液A的pH调节至9.5-10.8。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(2)所述浓缩、结晶是向洗脱液A中加入NaCl至3％-9％质量浓度，然后浓缩、置于5-10℃下进行结晶。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)中清液B的pH调节至6-8。在本专利技术的一种实施方式中，步骤(3)还包括：清液B的pH至6-8时，按照料液比1:(2-5)与阴离子交换树脂混合，然后除去上清液，将树脂进行清洗、洗脱、干燥，即得卵转铁蛋白。在本专利技术的一种实施方式中，所述方法具体包括如下步骤：(1)蛋液预处理：蛋清液搅拌，调节pH至6.5-9.5；(2)金属螯合阳离子树脂吸附：按照料液比1:5将树脂和预处理的蛋清液混合，加入0.05-0.4mM氯化铁溶液，吸附3-5h，吸附完成后移除上清A；(3)清洗：按照料液比1:3向已完成吸附的树脂中加入浓度为0.9％的NaCl溶液，振荡混匀后去除上清，重复清洗3-5次；(4)洗脱：向清洗的树脂中按照料液比1:3加入浓度为4-7％的NaCl溶液，振荡洗脱30min后收集清液，重复操作3-5次，收集所有洗脱液合并混匀得到洗脱液A；(5)结晶：将洗脱液A调节pH至9.5-10.8，加入NaCl至盐浓度3％-9％，采用超滤浓缩技术将洗脱液浓缩至蛋白浓度2-5％，在10℃下静置形成结晶，分别收集所得溶菌酶结晶和上清液B；(6)阴离子交换树脂吸附：取上清液B将pH值调至6-8，按照料液比1:3与阴离子交换树脂混合，吸附反应3-5h后除去上清液；(7)洗脱：将树脂用0.9％NaCl溶液清洗后，采用浓度为4-7％的NaCl溶液，振荡洗脱30min后收集清液，重复操作3-5次，收集所有洗脱液合并混匀得到洗脱液；(8)超滤和干燥：将洗脱液进行超滤脱盐，得到的超滤液干燥后即的卵转铁蛋白。本专利技术的第二个目的是将上述方法应用于蛋清中溶菌酶的提纯中。本专利技术的第三个目的是将上述方法应用于蛋清中卵转铁蛋白的提纯中。本专利技术的第四个目的是将上述方法应用于蛋清加工领域中。基于上述应用，增加蛋清的附加值，提高蛋清的利用度。有益效果：本专利技术方法可同时实现蛋清中溶菌酶和卵转铁蛋白的高效分离，得率均达75％以上、纯度均可达95％以上，并且所使用的方法具有操作简单、成本低的优势，易于产业化应用。附图说明图1为溶菌酶和卵转铁蛋白的分离方法流程图。具体实施方式本专利技术基于金属螯合阳离子树脂和结晶法联合分离蛋清中多种蛋白质，具体流程如图1所示。其中步骤(1)中pH范围为6.5-9.5，以实现溶菌酶和卵转铁蛋白的有效吸附，所得上清A中富含卵白蛋白和卵粘蛋白，沉淀B中富含溶菌酶和卵转铁蛋白。其中步骤(1)中选用的树脂类型为金属螯合阳离子树脂，是一种羧基型弱阳离子交换树脂，其羧基能通过金属螯合作用实现对卵转铁的吸附，并通过静电相互作用实现溶菌酶吸附。树脂吸附过程中加入0.05-0.4mM氯化铁溶液，吸附时间为3-5小时，以同时实现溶菌酶和卵转铁蛋白的有效吸附。步骤(2)中洗脱所用NaCl溶液浓度为4-7％，洗脱30min，收集的洗脱液A中含溶菌酶和卵转铁蛋白。步骤(2)中所述的结晶条件为pH9.5-10.8、蛋白浓度2-5％、NaCl浓度3％-9％，以保证溶菌酶有效结晶析出。所得清液B中含卵转铁蛋白及部分未结晶的溶菌酶。步骤(3)中对清液B进行阴离子交换树脂吸附，吸附条件为pH6-8，吸附反应时间3-5h，以保证卵转铁蛋白的有效，除去未结晶且未吸附的溶菌酶，洗脱阴离子交换树脂，洗脱条件同步骤(2)，所得洗脱液B中为卵转铁蛋白。蛋白纯度计算方法：采用SDS-PAGE对分离得到的溶菌酶和乱转铁蛋白进行定量分析，用凝胶成像系统对采集各蛋白条带，计算目标蛋白在总蛋白中所占的比例即得蛋白纯度。蛋白得率计算方法：采用凯氏定氮法测试分离出的蛋白的总含量，根据纯度计算目标蛋白含量m，按照同样的方法计算处理的蛋清中目标蛋白的总量m0，根据公式蛋白得率＝m/m0*100计算出目标蛋白的得率。实施例1：(1)蛋液预处理：蛋清液搅拌，调节pH至8；(2)金属螯合阳离子树脂吸附：按照料液比1:5将羧基型弱阳离子交换树脂和预处理的蛋清液混合，加入氯化铁，使得蛋清液中氯化铁摩尔浓度为0.2mmol/L，吸附5h，吸附完成后移除上清A；(3)清洗：按照料液比1:3向已完成吸附的树脂中加入浓度为0.9％的NaCl溶液，振荡混匀后去除上清，重复清本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种分离蛋清中溶菌酶和卵转铁蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)调节蛋清液pH至6.5‑9.5，然后加入阳离子交换树脂和三价铁源进行吸附分离；其中三价铁源中的铁离子相对蛋清液的摩尔浓度为0.05‑0.4mmol/L；(2)洗脱树脂，得到洗脱液A；调节洗脱液A的pH，浓缩、结晶，得到溶菌酶结晶和清液B；(3)调节清液B的pH，提纯浓缩得到卵转铁蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种分离蛋清中溶菌酶和卵转铁蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：(1)调节蛋清液pH至6.5-9.5，然后加入阳离子交换树脂和三价铁源进行吸附分离；其中三价铁源中的铁离子相对蛋清液的摩尔浓度为0.05-0.4mmol/L；(2)洗脱树脂，得到洗脱液A；调节洗脱液A的pH，浓缩、结晶，得到溶菌酶结晶和清液B；(3)调节清液B的pH，提纯浓缩得到卵转铁蛋白。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(1)中树脂与蛋清液的质量比为1：(2-5)。3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述三价铁源包括氯化铁、硫酸铁、硝酸铁中的一种或多种。4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，所述洗脱...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨严俊，苏宇杰，常翠华，李俊华，顾璐萍，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32