当前位置: 首页 > 专利查询>湖北大学专利>正文

一种人源溶菌酶编码基因及其在毕赤酵母中表达的方法和应用技术

技术编号:20884270 阅读:34 留言:0更新日期:2019-04-17 13:29
本发明专利技术涉及一种人源溶菌酶编码基因及其在毕赤酵母中表达的方法和应用,该酶的编码基因具有SEQ ID NO2所示的核苷酸序列。本发明专利技术所述的人溶菌酶以真核生物毕赤酵母GS115为表达宿主,结合基因拷贝数和辅助因子共表达策略,使得到的溶菌酶产物具有表达量高、活性高等优点,可以作为抗生素替代品,在饲料等领域进行广泛应用。

【技术实现步骤摘要】
一种人源溶菌酶编码基因及其在毕赤酵母中表达的方法和应用
本专利技术属于分子生物
,具体而言,涉及一种人源溶菌酶及编码基因其在毕赤酵母GS115中的大量表达和应用。
技术介绍
溶菌酶是一种分子量为14.4kDa的抗菌酶,在杀菌方面效果显著。溶菌酶通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,瓦解细菌(主要为革兰氏阳性菌)的细胞壁结构,促使细胞破裂,从而导致细菌死亡。由于其杀菌效果良好,主要应用于医疗、食品、饲料和科学研究中。根据分子结构、来源和分子量的不同,溶菌酶可以分为6类:植物溶菌酶、微生物溶菌酶、噬菌体溶菌酶以及3种动物类型的溶菌酶(c型、g型和i型),其中动物溶菌酶和噬菌体溶菌酶最常见,而研究最多的鸡溶菌酶和人源溶菌酶属于动物溶菌酶的c型溶菌酶。有文献报道,虽然鸡溶菌酶是目前使用最广的一种溶菌酶,但人源溶菌酶的活性和热稳定性均强于鸡溶菌酶。然而,已有的人源溶菌酶在多种表达宿主中进行异源表达时,普遍存在表达量比较低的情况,使其在工业化推广应用方面存在问题。
技术实现思路
鉴于现有技术的不足,本专利技术的第一个目的在于通过优化人源溶菌酶编码基因序列,从而提供一种人源溶菌酶及其编码基因和重组载体、转化体以及遗传工程化的宿主细胞。为了实现本专利技术的目的,专利技术人通过大量试验研究并不懈努力,最终获得了如下技术方案:一种人源溶菌酶的编码基因,该编码基因具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。需要说明的是,本专利技术涉及的人源溶菌酶,其具有SEQIDNO.1所示的氨基酸序列。一种重组载体,包括上述的人源溶菌酶的编码基因。进一步优选地,所述重组载体是在pHBM905M载体的CpoI和NotI位点插入所述人源溶菌酶的编码基因,再通过生物砖技术将整个人源溶菌酶的表达框重复构建获得6-12或6-8拷贝。本专利技术还提供两种转化体,转化体可以为重组菌,包含上述重组载体。例如,将人源溶菌酶编码基因插入载体pHBM905M的CpoI和NotI位点得到的重组表达载体,及含有基因多拷贝表达框的重组表达载体转化至毕赤酵母GS115得到重组菌。另外一种转化体为以人源溶菌酶6拷贝GS115重组菌,再次转入辅助因子(Ero1、Pdi1)进行共表达的一种新型重组菌。本专利技术还提供多对引物,用于扩增上述的人源溶菌酶编码基因全长及共表达所需的各种辅助因子。一种遗传工程化的宿主细胞,所述的宿主细胞含有上述的重组载体。进一步优选地,所述遗传工程化的宿主细胞还包含插入辅助因子Ero1或/和Pdi1基因序列的重组载体。所述重组载体为载体pGAPZB的EcoRI和AgeI位点插入目标基因得到的重组表达载体。人源溶菌酶属于真核基因,研究发现其存在翻译后修饰。而本专利技术人选用的毕赤酵母GS115存在真核基因具有的翻译后修饰特点,且能够进行分泌表达和高密度发酵,满足工业化应用的条件。因此,我们选择毕赤酵母GS115作为出发菌株进行人源溶菌酶的表达。最后,本专利技术还提供了上述的人源溶菌酶在制备杀菌剂中的应用。与现有技术相比,本专利技术具有如下几点的进步性:(1)利用体外构建无抗生素筛选标记的多拷贝的方法,实现了人溶菌酶的高量表达,且拷贝数与表达量并不是成正比;(2)不同辅助因子的共表达,实现了人溶菌酶表达量的进一步提高,其中Ero1促进作用最强;(3)人溶菌酶表达量和活性均为目前报道最高。附图说明图1为人源溶菌酶多拷贝构建验证DNA电泳图,其中泳道1/2/3/4/5/6分别为人溶菌酶1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝、6拷贝、12拷贝质粒。图2为人源溶菌酶多拷贝构建质粒酶切验证DNA电泳图,其中泳道1/2/3/4/5/6分别为用XbaI和BamHI双酶切1拷贝、2拷贝、3拷贝、4拷贝、6拷贝、12拷贝。图3为人源溶菌酶6拷贝和12拷贝菌株表达的SDS-PAGE检测图,其中泳道1和2分别为12拷贝和6拷贝。图4为辅助因子和人源溶菌酶共表达SDS-PAGE检测图,其中泳道1/2/3/4分别为人溶菌酶6拷贝菌株、辅助因子Bip共表达菌株、辅助因子Ero1共表达菌株、辅助因子Pdi1共表达菌株。具体实施方式以下结合附图对本专利技术的原理和特征进行描述,所举实例只用于解释本专利技术,并非用于限定本专利技术的范围。下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明,均为常规方法;所用的材料、试剂等,如无特殊说明,均可从商业途径得到。实施例1、人源溶菌酶基因序列密码子优化将来源于人源溶菌酶基因的序列进行一定程度的密码子优化:a、减少连续的A/T/G/C碱基出现几率,避免产生茎环结构;b、在整个基因序列中,增加一些稀有密码子,特别是翻译起始阶段,来降低核糖体的延伸速率。优化后的人源溶菌酶基因序列如SEQIDNO.2所示,整个序列和原始序列相比优化率达23.2%。实施例2、表达载体的构建及蛋白质表达1、基因序列的人工合成SEQIDNO.2所示的核苷酸序列委托上海生物工程有限公司按照本领域的常规技术进行基因人工合成,基因插入质粒载体pUC57中,保存,备用。2、基因序列的扩增根据SEQIDNO.2所示的核苷酸序列设计引物对(hLYZ-F、hLYZ-R)正向引物的下划线部分为CpoI的酶切位点,反向引物的下划线部分为NotI酶切位点,此位点的序列设计符合T4DNA聚合酶作削的方法所产生的粘性末端。PCR反应体系:PCR反应条件:95℃预变性5min,95℃变性30s,57℃退火30s,72℃延伸30s,30轮循环扩增,最后72℃延伸10min。用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物,并用DNA纯化试剂盒(GeneMark公司生产)纯化。3、重组表达载体的构建1)将上述纯化的PCR产物用T4DNA聚合酶作削的方法处理,然后进行溶液回收产物。2)将质粒pHBM905M用CpoI和NotI双酶切,琼脂糖电泳回收酶切产物。3)将步骤1)的溶液回收产物和步骤2)的酶切产物进行连接,连接产物转化大肠杆菌Gold后涂布于含有100μg/mL氨苄抗生素的LB平板,37℃过夜培养,将得到的转化子用引物hLYZ-F和hLYZ-R进行菌落PCR,筛选到含有人源溶菌酶基因的重组菌,抽提重组菌的质粒并进行测序验证。结果表明,在pHBM905M的CpoI和NotI酶切位点之间插入了人源溶菌酶的DNA片段,该片段包括SEQIDNO.2的自5′端起第4至393位的核苷酸,插入方向正确。将该重组质粒命名为pHBM905M-hLYZ。4、人源溶菌酶多拷贝质粒的构建重组载体pHBM905M-hLYZ表达框的5’端含有XbaI酶切位点,3’端含有SpeI和BamHI酶切位点。因XbaI和SpeI为同尾酶,故利用XbaI/BamHI两种酶双酶切得到表达框,SpeI/BamHI两种酶双酶切得到线性化的载体,再把酶切回收得到的片段和载体通过T4DNA连接酶连接就可以得到我们所需的人源溶菌酶2拷贝质粒,命名为pHBM905M-hLYZ-2C。如此类推,通过这3种酶酶切酶连的方法,我们可以得到3拷贝,4拷贝,6拷贝以及更高的12拷贝质粒,分别命名为pHBM905M-hLZY-3C,pHBM905M-hLZY-4C,pHBM905M-hLYZ-6C,pHBM905M-hLYZ-12C。如图1所示,构建成功的多拷贝质粒,其分子量大小会呈现一个本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种人源溶菌酶的编码基因,其特征在于,所述基因具有SEQ I D NO.2所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种人源溶菌酶的编码基因,其特征在于,所述基因具有SEQIDNO.2所示的核苷酸序列。2.一种重组载体,其特征在于,包括权利要求1所述人源溶菌酶的编码基因,所述编码基因的拷贝数为6-12。3.根据权利要求2所述的重组载体,其特征在于,包括权利要求1所述人源溶菌酶的编码基因,所述编码基因的拷贝数为6-8。4.根据权利要求2所述的重组载体,其特征在于,所述重组载体是在pHBM905M载体的CpoI和NotI位点插入所述人源溶菌酶的编码基因,再通过生物砖技术将整个人源溶菌酶的表达框重复构建获得6-12拷贝。5.一种转化体,其特征在于,包含权利要求2或3或4所述的重组载...

【专利技术属性】
技术研发人员:易犁何华华吴世杰张桂敏
申请(专利权)人:湖北大学
类型:发明
国别省市:湖北,42

网友询问留言 已有0条评论
  • 还没有人留言评论。发表了对其他浏览者有用的留言会获得科技券。

1