一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用制造技术

本发明专利技术公开了一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用，属于基因工程以及微生物工程技术领域。本发明专利技术提供的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示的内切菊粉酶INU3B具有高比酶活和催化活性，其比酶活、最大反应速率(Vmax)、催化常数(Kcat)、底物亲和力(Km)和催化效率(Kcat/Km)分别可达2262.82±82.25U/mg、2564.1μmol·mg

An Endogenous Inulinase and Its Application in the Production of Fructooligosaccharides

【技术实现步骤摘要】
一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用
本专利技术涉及一种内切菊粉酶及其在生产低聚果糖中的应用，属于酶工程和微生物工程

技术介绍
低聚果糖为由2～10个果糖组成的低聚化合物，又称果寡糖，具有抗肿瘤和改善胃肠功能的作用，也可作为膳食纤维用于防治糖尿病和减肥，还可用于降低血脂和预防高胆固醇等，因此，低聚果糖在食品领域有着极其广泛的应用，常被用于糖果、水果制品、牛奶制品、酸奶、鲜奶酪、烘焙食品和冰淇淋等的制作中。目前，国内外生产低聚果糖的工艺主要有两种，一种是利用果糖基转移酶水解蔗糖生产低聚果糖(fructooligosaccharides，FOS)，此水解过程会产生大量的副产物葡萄糖，而葡萄糖又会进一步抑制水解反应并降低产率，这使得利用此水解过程获得低聚果糖(fructooligosaccharides，FOS)的最终产率低于55％且所得产物不易分离纯化；另一种是利用内切菊糖酶(EC3.2.1.7)水解菊粉来获得较高纯度的低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)，此水解过程的副产物仅有少量的蔗糖、葡萄糖和果糖，这使得利用此水解过程获得的低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)的纯度可高达90％且所得产物易分离纯化。因此，利用内切菊糖酶(EC3.2.1.7)水解菊粉生产低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)的工艺有极大的潜力取代传统的利用果糖基转移酶水解蔗糖生产低聚果糖(fructooligosaccharides，FOS)的工艺，成为低聚果糖工业化生产中最重要的工艺之一。但是，现有的内切菊糖酶(EC3.2.1.7)普遍具有比酶活较低的缺陷，完全不能满足低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)工业化生产的要求，例如，TohruKobayashi等人从Microbulbifersp.中分离得到的内切菊粉酶的比酶活仅可达到38.2U/mg(参考文献：Cloningandsequencingofinulinaseandbeta-fructofuranosidasegenesofadeep-seaMicrobulbiferspeciesandpropertiesofrecombinantenzymes)；YangLi等人从Arthrobactersp.S37中分离得到的内切菊粉酶的比酶活仅可达到93.4U/mg(参考文献：PurificationandcharacterizationofanendoinulinasefromXanthomonasoryzaeNo.5)。这无疑大大限制了低聚果糖的工业化生产进程，因此，急需获取一种具有高比酶活的内切菊粉酶以促进低聚果糖的工业化生产进程。
技术实现思路
[技术问题]本专利技术要解决的技术问题是提供一种具有高比酶活的内切菊粉酶。[技术方案]为解决上述问题，本专利技术提供了一种内切菊粉酶(EC3.2.1.7)，所述内切菊粉酶为：(a)由SEQIDNo.1或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有内切菊粉酶活性的由(a)衍生的蛋白质。本专利技术还提供了编码上述内切菊粉酶的基因。在本专利技术的一种实施方式中，所述基因的核苷酸序列如SEQIDNo.2或SEQIDNo.4所示。本专利技术还提供了携带上述基因的重组质粒。在本专利技术的一种实施方式中，所述重组质粒的载体为pET22b(+)载体。本专利技术还提供了携带上述基因或上述重组质粒的宿主细胞。在本专利技术的一种实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。本专利技术还提供了上述内切菊粉酶的制备方法，将权利要求5或6所述宿主细胞加入到培养基中培养至OD600＝0.6～0.8后，在发酵液中添加IPTG继续诱导培养10～30h，得到内切菊粉酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养基包含LB培养基或TB培养基。在本专利技术的一种实施方式中，所述培养的温度为20℃、转速为220rpm。在本专利技术的一种实施方式中，所述IPTG在发酵液中的浓度为0.1mmol/L。本专利技术还提供了应用上述方法制备得到的内切菊粉酶。本专利技术还提供了上述内切菊粉酶或上述基因或上述重组质粒或上述宿主细胞或上述制备方法或上述制备得到的内切菊粉酶在生产低聚果糖方面的应用。本专利技术还提供了一种生产低聚果糖的方法，将上述内切菊粉酶加入到含有菊粉的缓冲液进行转化，得到低聚果糖。在本专利技术的一种实施方式中，所述缓冲液为乙酸铵缓冲液。在本专利技术的一种实施方式中，所述乙酸铵缓冲液的浓度为50mmol/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述乙酸铵缓冲液的pH为5.5。在本专利技术的一种实施方式中，所述转化的温度为40～70℃、时间为0.5～2h。[有益效果](1)本专利技术提供的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的内切菊粉酶INU3B具有高比酶活和催化活性，其比酶活、最大反应速率(Vmax)、催化常数(Kcat)、底物亲和力(Km)和催化效率(Kcat/Km)分别可达2262.82±82.25U/mg、2564.1μmol·mg-1min-1、2393.2s-1、10.6mg·mL-1以及225.77s-1·mg-1·mL，能够满足内切菊粉酶以及低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)工业化生产的要求，在食品领域具有极高的应用前景；(2)利用本专利技术的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的内切菊粉酶INU3B水解菊粉生产得到的低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)纯度较高，可高达93.8％，并且，利用本专利技术的氨基酸序列如SEQIDNo.1所示的内切菊粉酶INU3B水解菊粉生产低聚果糖(inulooligosaccharides，IOS)的副产物较少，仅有少量的蔗糖，易分离纯化，更适用于大规模工业化生产。附图说明图1：INU3B与已知内切菊粉酶的氨基酸序列比对结果图。图2：inu3A、inu3B、inu3C基因的结构示意图。图3：重组质粒pET22b(+)-inu3B的图谱。图4：INU3B表达纯化后的SDS-PAGE凝胶图。图5：INU3B在不同温度条件下的酶活变化。图6：INU3B在不同温度条件下保存1h后的酶活变化。图7：INU3B在不同pH条件下的酶活变化。图8：INU3B在不同pH条件下保存24h后的酶活变化。图9：INU3B的酶反应初速度与底物浓度的关系；其中，V表示INU3B的酶反应初速度，[S]表示底物浓度。图10：INU3B以菊粉为底物进行转化反应时的产物分析HPLC图谱；其中，(a)为标准品G、GF、GF2、GF3、GF4和GF5的HPLC图谱分析；(b)为转化反应0min时的产物分析HPLC图谱；(c)为转化反应30min时的产物分析HPLC图谱。具体实施方式下面结合具体实施例，对本专利技术进行进一步的阐述。下述实施例中涉及的酵母(LipomycesstarkeyiNRRLY-11557)购自日本技术评价研究所生物资源中心(NITEBiologicalResourceCenter)，产品编号为：NBRC10381；下述实施例中涉及的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)购自北京索莱宝科技有限公司；下述实施例中涉本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种内切菊粉酶，其特征在于，所述内切菊粉酶为：(a)由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有内切菊粉酶活性的由(a)衍生的蛋白质。

【技术特征摘要】
1.一种内切菊粉酶，其特征在于，所述内切菊粉酶为：(a)由SEQIDNo.1或SEQIDNo.3所示的氨基酸序列组成的蛋白质；或者，(b)在(a)中的氨基酸序列经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有内切菊粉酶活性的由(a)衍生的蛋白质。2.编码权利要求1所述内切菊粉酶的基因。3.携带权利要求2所述基因的重组质粒。4.如权利要求3所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒的载体为pET22b(+)载体。5.携带权利要求2所述基因或权利要求3或4所述重组质粒的宿主细胞。6.如权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞为大肠杆菌。7.权利要求1所...

【专利技术属性】
技术研发人员：钮成拓，包敏，罗骄阳，李崎，刘春凤，王金晶，郑飞云，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32