木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体及其制备方法和用途技术

本发明专利技术涉及木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体、编码该突变体的多核苷酸、重组载体、重组菌、制备该突变体的方法及该突变体的用途。其中，通过对氨基酸序列为SEQ ID No.3的木聚糖酶进行T32R突变，获得木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体。与野生型的木聚糖酶AnXyn10C相比，木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体在保持木糖降解活性的同时，表现出良好的热稳定性。

T32R Mutant of Xylanase AnXyn10C and Its Preparation and Application

【技术实现步骤摘要】
木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体及其制备方法和用途
本专利技术涉及蛋白质工程领域。具体而言，本专利技术涉及通过对木聚糖酶AnXyn10C的关键位点进行点突变，获得热稳定性更好的木聚糖酶AnXyn10C突变体。
技术介绍
根据已有的报道，广义上的木聚糖酶分为三种，分别是β-1,4-D-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)、β-1,4-D-外切木聚糖酶(EC3.2.1.92)以及β-木糖苷酶(EC3.2.1.37)。其中，β-1,4-D-内切木聚糖酶(EC3.2.1.8)是降解木聚糖的最主要的酶，该酶作用于β-1,4-木聚糖的主链，并以内切的方式水解木聚糖中的β-1,4-糖苷键，该酶降解木聚糖产生低聚木糖等水解产物。β-1,4-D-外切木聚糖酶(EC3.2.1.92)作用于寡聚木糖及木聚糖的非还原端。Β-木糖苷酶通过水解低聚木糖的末端来催化释放木糖残基。此外，狭义的木聚糖酶是指β-1,4-D-内切木聚糖酶(EC3.1.2.8)，该酶目前已广泛应用于生物能源、造纸、食品、饲料行业。目前已知木聚糖酶属于糖基水解酶的一种，根据其氨基酸序列、三维结构、催化位点的几何学性质，木聚糖酶可归类为第5家族、第7家族、第10家族(即F家族)和第11家族(即G家族)等。此外，根据现有的研究发现，第10家族木聚糖酶的来源主要包括：地细菌、海洋藻类、真菌、酵母菌；第11家族木聚糖酶的来源主要包括：黑曲霉(Aspergillusniger)、里氏木霉(Trichodermareesei)、短小芽孢杆菌(Bacilluspumilus)、枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)、变青链霉菌(Streptomyceslividans)、哈茨木霉(Trichodermaharzianum)、粪肥纤维单胞菌(Cellulomonasefimi)、环状芽孢杆菌(Bacilluscirculans)等。木聚糖酶具有如下的功能区：催化结构域(CatalytcDomains，CD)、碳水化合物结合结构域(carbohydrate-bindingmodule，CBM)或纤维素结合结构域(CelluloseBindingDomains，CBD)、木聚糖结合结构域(XylanbindingDomains，XBD)、连接序列(Linkersequence)和重复序列(Repeatedsequences)。其中，F/10家族木聚糖酶的催化结构域具有(β/α)8桶状结构，即TIM桶状结构；(β/α)8桶状结构在酶结构中十分常见，其中，由β折叠和α螺旋构成二级结构的框架，而环包含同其催化活性相关的氨基酸。F/10家族木聚糖酶的疏水核心只包含形成β折叠的残基。β折叠和α螺旋的相对位置主要靠具有支链的疏水氨基酸缬氨酸、异亮氨酸和亮氨酸来维持。F/10家族木聚糖酶一般具有碳水化合物结合结构域CBM，而仅有少数G/11家族木聚糖酶具有CBM。G/11家族木聚糖酶的结构主要为β折叠，蛋白整体呈“右手”型。其中，8种G/11家族木聚糖酶的三维结构为“三明治”形状，包括1个α螺旋和2个β折叠，形成能容纳1个木聚糖聚合物的巨大的间隙。木聚糖酶三维结构中各功能区一般由富含羟基的连接序列(即，环)相连。所述环包含有较多的丝氨酸、脯氨酸或苏氨酸残基，并高度糖基化，从而能够有效抑制外源蛋白酶对酶分子的降解。连接序列通常富含柔性氨基酸，从而形成柔韧的铰链区，使得各个结构域在空间上分离，并在宏观上表现为无规则卷曲。这样的排列有助于结构域各自发挥功能并维持空间构象的稳定。研究表明，连接肽可辅助木聚糖酶经由CBM锚定于细胞壁表面，以催化降解复杂底物。就催化机理而言，木聚糖酶参与的水解反应为典型的酸/碱催化的亲核水解反应。根据产物异头构象的不同，木聚糖酶降解木聚糖的催化反应可分为两大类：保持异头构象的双替换反应(图1A)和形成倒位异头构象的一步置换反应(图1B)。第5家族、第7家族、第10家族和第11家族的木聚糖酶可通过活性中心谷氨酸(Glu)残基(分子平均间距)的双替换反应完成催化过程。以褐色高温单孢菌木聚糖酶(Thermomonosporafuscaxylanase，Tfx)为例，首先，活性中心的其中一个谷氨酸残基E85作为质子供体，将H+提供给C1-O4键的O4上，使C1-O4键断裂，而另一谷氨酸残基E174作为亲核剂与氧碳键相互作用或促使水分子形成羟基，从而生成具有环内碳正离子的中间过渡物。随后，糖片段从活性部位移去，生成的碳正离子促使初始还原糖的环变形，并通过与离子化的Glu/Asp的羧基的共价作用而稳定。最后，水分子从糖苷的氧侧进入，将羟基加到碳正离子，之前产生的离子化的Glu羧基解离，使得羟基与碳正离子反应，从而得以将质子加到亲核基团上，Glu羧基被还原。在该过程中，反应产物可保持异头构象(参见图1A)。另一催化方式为一步置换反应，由一个普通酸Glu、一个普通碱Glu-/Asp-和亲核水分子的攻击一次完成的。在这个过程中，酸催化剂Glu的羧基提供H给O4，碱催化剂Glu/Asp作用于亲核试剂水，使羟基与碳正离子作用，羟基的异头构象发生倒置。同时，产生的H+通过扩散与离子化的酸催化剂结合，恢复质子状态(参见图1B)。木聚糖酶的催化关键位点包含组氨酸等极性氨基酸残基或谷氨酸等酸性氨基酸残基。例如，来源于Streptomyceslividans的木聚糖酶XlnA的活性区具有3个组氨酸(H)残基，其中H81和H207为F/10木聚糖酶超家族的4/7保守氨基酸残基(这两个具有催化作用的残基分别位于第4个和第7个β折叠的碳端)。H81和H207与E236通过氢键缔合，形成电荷网，使得两个催化残基保持离子状态，从而有效地对木聚糖的β-1,4-糖苷键进行水解。就XlnA而言，木聚糖酶的作用机制可能是广义的酸碱催化机制，谷氨酸和天冬氨酸等酸性氨基酸残基起着催化残基的作用，它们与空间位置相近的其它极性氨基酸残基相互作用，使得两个催化残基维持离子状态，并保持中间产物的稳定性以及酶的催化活性。一些文献对不同来源的木聚糖酶的晶体结构进行了解析，发现这些木聚糖酶的两个谷氨酸残基(例如Glu93和Glu182、Glu79和Glu170、Glu86和Glu177、Glu120和Glu209)形成一对催化残基。木聚糖酶的催化活性受到温度、pH等多种因素的影响。特别地，影响不同家族的木聚糖酶热稳定性的影响因素可能不同。例如，使得F/10家族木聚糖酶具有较强热稳定性的因素包括：①疏水中心的有效包埋；②α螺旋的N端存在脯氨酸；③带电侧链与螺旋偶极子的相互作用；④不存在太长的环状结构。另外，氢键和盐桥对于F/10家族木聚糖酶的热稳定性没有太大影响。就G/11家族木聚糖酶热稳定性而言，研究表明，特定位点的突变，如Gly→X、X→Pro，对提高G/11家族木聚糖酶的热稳定性十分有效；而在多种G/11木聚糖酶蛋白的保守区以Val代替Leu或Ile，在α-螺旋区以Ala代替Leu或Ile对木聚糖酶的热稳定性也有影响。另外，与芳香族氨基酸的相互作用相比，盐桥对G/11家族木聚糖酶的热稳定性影响较弱。同源性比较结果还显示，二硫键的形成对G/11家族木聚糖酶热稳定性影响不大。目前，已有诸多研究致力于改善木聚糖酶本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体，其中，所述木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体具有通过SEQ ID No.1表示的氨基酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体，其中，所述木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体具有通过SEQIDNo.1表示的氨基酸序列。2.一种编码权利要求1所述的木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体的多核苷酸，其中，所述多核苷酸具有通过SEQIDNo.2表示的序列。3.一种重组载体，其中，所述重组载体包含权利要求2所述的编码木聚糖酶AnXyn10C的T32R突变体的多核苷酸；优选地，所述重组载体采用选自质粒载体、噬菌体载体和病毒载体中的任一种构建；进一步优选，所述重组载体采用选自如下的载体中的一种或多种构建得到：pPIC9K、pPICZα、pGAPZ、pGAPZα、pGAPZαA和pPICZ；更优选，所述重组载体采用pPIC9K构建得到。4.一种重组菌，所述重组菌包含权利要求3所述的重组载体或在所述重组菌的基因组中整合有权利要求2所述的多核苷酸；优选地，用于构建所述重组菌的宿主菌选自毕赤酵母、假丝酵母、多型汉逊酵母、球拟酵母、裂殖酵母和克鲁维酵母；进一步优选地，所述宿主菌为毕赤酵母；更优选地，所述宿主菌为毕赤酵母GS115。5.一种制备木...

【专利技术属性】
技术研发人员：武国庆，熊强，沈乃东，李文钊，周娜娜，张宏嘉，李冬敏，冯鹏，陈晓园，王慧丽，
申请(专利权)人：中粮集团有限公司，中粮营养健康研究院有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11