一种葡萄糖苷酶突变体及其应用制造技术

本发明专利技术公开了一种葡萄糖苷酶突变体，该突变体是通过对来源于Terrabacter ginsenosidimutans的葡萄糖苷酶野生型亲本的基因进行定点突变人工获得的，该突变体酶相较于其野生型亲本的酶活性大大提高，催化Rg3转化成Rh2的选择性更高，适用于工业化酶法生产Rh2，且成本低廉。

A Glucosidase Mutant and Its Application

The present invention discloses a mutant of glucosidase, which is artificially obtained by site-directed mutagenesis of the gene from wild-type parents of Terrabacter ginsenosidimutans. Compared with wild-type parents, the mutant enzymes have much higher enzymatic activity, higher selectivity in catalyzing Rg3 to Rh2, and are suitable for industrial enzymatic production of Rh2 at a cost. Low cost.

【技术实现步骤摘要】
一种葡萄糖苷酶突变体及其应用本申请是申请号201780002296.2、申请日2017年11月30日、专利技术名称“一种酶催化合成人参皂苷Rh2的方法”的分案申请。
本专利技术属于天然化合物合成领域，具体涉及一种通过基因工程手段人工获得的葡萄糖苷酶突变体、以及酶催化合成人参皂苷Rh2的方法。
技术介绍
人参历史悠久，作为一种传统名贵中药，具有优良的药用价值。人参主要活性成分为人参皂苷，包括三种类型，分别为：原人参二醇类皂苷(Protopanaxadioltypeginsenoside，PPD)、原人参三醇类皂苷(Protopanaxatrioltypeginsenoside，PPT)和人参皂苷Ro。人参中绝大部分皂苷是Rb1、Rb2、Rc、Rd、Re和Rg1人参皂苷。其中稀有人参皂苷Rh2在自然界含量极少。人参皂苷Rh2是一种新近发现的抗肿瘤、抗转移的天然植物成分，是配合放疗、化疗增效减毒的首选药物，作为新型抗癌强身保健品深受市场欢迎。人参皂苷的化学结构通式为：其种类及结构特征如表1所示。表1人参皂苷的种类及结构特征注：Glu：葡萄糖；Araf：阿拉伯呋喃糖；Arap：阿拉伯吡喃糖；Rha：鼠李糖现有技术中存在许多制备人参皂苷Rh2的方法，如CN102352402B公开了从参根中提取含有人参自身皂苷酶和其它水溶性物质的提取物，与原人参二元醇类皂苷反应制备Rh2混合皂苷。CN101565694A公开了利用三七人参皂苷酶转化三七皂苷为活性更高的Rg3、CK、Rh2次生皂苷和苷元。CN101385519A公开了利用一种皂苷酶活性高的谷物芽产生的酶液，与人参粉或人参总皂苷或人参皂苷Rb1混合，在40-50℃搅拌反应10-24小时，产生含F2、Rg3、CK、Rh2等人参皂苷。还有些方法需使用全细胞进行反应，不利于酶和底物的充分接触，从而会影响转化率，造成反应选择性低，Rh2产量低、纯度低；如CN1105781C专利，利用β-葡萄糖苷酶水解人参皂苷得到少量的人参皂苷Rh2，转化率低，造成反应选择性低，Rh2产量低、纯度低。可见，现有常见的人参皂苷Rh2的制备方法，存在许多缺点，如选择性低，Rh2含量低不能制备高纯物，工艺粗糙，不适宜放大生产等。
技术实现思路
为了解决上述存在的问题，本专利技术对野生型葡萄糖苷酶进行突变，获得酶活性大大提高、人参皂苷Rh2转化率大大提高的葡萄糖苷酶突变体。本专利技术的目的之一在于提供葡萄糖苷酶突变体。本专利技术的另一目的在于提供葡萄糖苷酶突变体的应用。本专利技术的另一目的在于提供葡萄糖苷酶突变体的人参皂苷Rh2的制备方法。本专利技术所采取的技术方案是：一种酶催化合成人参皂苷Rh2的方法，以人参皂苷Rg3为底物，在葡萄糖苷酶的催化下，反应生成人参皂苷Rh2；所述葡萄糖苷酶来源于Terrabacterginsenosidimutans；催化反应的温度为25～50℃；催化反应体系中人参皂苷Rg3的浓度为1％～5％w/v，葡萄糖苷酶用量为底物人参皂苷Rg3重量的0.01～0.06倍，余量为水或磷酸盐缓冲液，以及用于溶解人参皂苷Rg3的助溶剂；所述催化反应体系的pH值为6.5～9.5。进一步的，所述葡萄糖苷酶的氨基酸序列如SEQIDNO2所示，或者为SEQIDNO2所示氨基酸序列经以下至少一种突变情况所得：将第71和72位的谷氨酸E、缬氨酸V分别突变为苏氨酸T、谷氨酸E；将第92位的谷氨酰胺Q突变为组氨酸H；将第109和114位的丝氨酸S、脯氨酸P分别突变为丙氨酸A、甘氨酸G；将第135位的脯氨酸P突变为丙氨酸A；将第168位的苯丙氨酸F突变为酪氨酸Y；将第240位的谷氨酰胺Q突变为谷氨酸E；将第344位的赖氨酸K突变为精氨酸R；将第412和416位的谷氨酸E、天冬氨酸D分别突变为天冬氨酸D、谷氨酸E；将第469位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F。进一步的，所述人参皂苷Rg3的助溶剂选自甲醇、乙醇、1％～20％v/v的DMSO中的至少一种。更进一步的，所述人参皂苷Rg3的助溶剂为1％～20％v/v的DMSO。进一步的，所述催化反应的时间为4～12h。进一步的，所述磷酸盐缓冲液为pH7.2～7.8的0.08～0.12M磷酸盐缓冲液。进一步的，人参皂苷Rg3需先溶解于助溶剂中，再缓慢加入葡萄糖苷酶中，边加入边搅拌。缓慢加入可避免溶于助溶剂中的Rg3形成粘稠状的液体，从而导致搅拌子无法转动。在上述三种助溶剂中，以DMSO出现此类现象的程度最低，另两种溶剂更容易出现这种现象。进一步的，所述葡萄糖苷酶以酶粉或酶液形式加入。进一步的，所述酶液是将菌体用磷酸缓冲液超声波破胞、离心取上清得到。葡萄糖苷酶突变体，由SEQIDNO2所示氨基酸序列经以下至少一种突变情况所得：将第71和72位的谷氨酸E、缬氨酸V分别突变为苏氨酸T、谷氨酸E；将第92位的谷氨酰胺Q突变为组氨酸H；将第109和114位的丝氨酸S、脯氨酸P分别突变为丙氨酸A、甘氨酸G；将第135位的脯氨酸P突变为丙氨酸A；将第168位的苯丙氨酸F突变为酪氨酸Y；将第240位的谷氨酰胺Q突变为谷氨酸E；将第344位的赖氨酸K突变为精氨酸R；将第412和416位的谷氨酸E、天冬氨酸D分别突变为天冬氨酸D、谷氨酸E；将第469位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F。进一步的，葡萄糖苷酶突变体由SEQIDNO1所示核苷酸序列经以下至少一种突变情况所得：将第211～216位的碱基序列GAGGTG突变为ACGGAG；将第274～276位的碱基序列CAG突变为CAC；将第325～327位和340～342位的碱基序列AGC、CCG分别突变为GCC、GGT；将第403～405位的碱基序列CCG突变为GGC；将第502～504位的碱基序列TTC突变为TAC；将第718～720位的碱基序列CAA突变为GAA；将第1030～1032位的碱基序列CGG突变为AAG；将第1234～1236位和1246～1248位的碱基序列GAG、GAT分别突变为GAC、GAG；将第1405～1407位的碱基序列TAT突变为TTT。上述任一项所述的葡萄糖苷酶突变体在制备人参皂苷Rh2中的应用。进一步的，上述应用中以人参皂苷Rg3为底物。本专利技术的有益效果是：(1)本专利技术来源于Terrabacterginsenosidimutans的葡萄糖苷酶及其突变体酶活对底物Rg3转化成Rh2的转化率达95.89％以上，转化率大大提高，反应选择性高，副产物少，Rh2含量高，可用于制备高纯Rh2，有利于进一步通过酶法工业化生产人参皂苷Rh2。(2)本专利技术生产人参皂苷Rh2的工艺简单，反应选择性高，副产物少，本专利技术葡萄糖苷酶及其突变体经大肠杆菌发酵易得，生产成本和产品质量优于化学法，适合工业化生产。反应条件温和，属于环境友好型生产工艺，符合国家推广的绿色环保工业标准。(3)本专利技术方法中采用催化反应温度25～50℃、pH值6.5～9.5、底物Rg3浓度为1％～5％w/v、葡萄糖苷酶用量为Rg3重量0.01～0.06倍等技术特征，更有利于Terrabacterginsenosidimutans葡萄糖苷酶及其突变体酶活对底物Rg3的催化活性，提高其将Rg3转化成Rh2的转化率，可达95.89％以上，降低了副产物的产生，提高所得Rh2的纯度，更有利于酶法生产本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，由SEQ ID NO 2所示氨基酸序列经以下至少一种突变情况所得：将第71和72位的谷氨酸E、缬氨酸V分别突变为苏氨酸T、谷氨酸E；将第92位的谷氨酰胺Q突变为组氨酸H；将第109和114位的丝氨酸S、脯氨酸P分别突变为丙氨酸A、甘氨酸G；将第135位的脯氨酸P突变为丙氨酸A；将第168位的苯丙氨酸F突变为酪氨酸Y；将第240位的谷氨酰胺Q突变为谷氨酸E；将第344位的赖氨酸K突变为精氨酸R；将第412和416位的谷氨酸E、天冬氨酸D分别突变为天冬氨酸D、谷氨酸E；将第469位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F。

【技术特征摘要】
1.葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，由SEQIDNO2所示氨基酸序列经以下至少一种突变情况所得：将第71和72位的谷氨酸E、缬氨酸V分别突变为苏氨酸T、谷氨酸E；将第92位的谷氨酰胺Q突变为组氨酸H；将第109和114位的丝氨酸S、脯氨酸P分别突变为丙氨酸A、甘氨酸G；将第135位的脯氨酸P突变为丙氨酸A；将第168位的苯丙氨酸F突变为酪氨酸Y；将第240位的谷氨酰胺Q突变为谷氨酸E；将第344位的赖氨酸K突变为精氨酸R；将第412和416位的谷氨酸E、天冬氨酸D分别突变为天冬氨酸D、谷氨酸E；将第469位的酪氨酸Y突变为苯丙氨酸F。2.根据权利要求2所述的葡萄糖苷酶突变体，其特征在于，由SEQIDNO1所示核苷酸序列经以下至少一种突变情况所得：将第211～216...

【专利技术属性】
技术研发人员：傅荣昭，
申请(专利权)人：邦泰生物工程深圳有限公司，江西邦泰绿色生物合成生态产业园发展有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44