一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法技术

本发明专利技术属于基因工程技术领域，公开了一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，将信号肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同时木聚糖酶基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子，PCR产物回收得到目的基因核苷酸序列Signal peptide‑Xylnase‑6×His，将目的基因克隆表达载体pET28a中，测序确认得到正确的重组表达载体；将重组表达载体转化至大肠杆菌菌株；向样品中添加IPTG，样品诱导培养；实现木聚糖酶的高效分泌表达。本发明专利技术能够将木聚糖酶直接分泌到培养基中；相比于原来的大肠杆菌胞内和或者酵母分泌表达，既能保证高的木聚糖酶活性，同时更容易操作，更省时，且成本更低。

A New Method for Xylanase Secretion and Expression in Escherichia coli

The invention belongs to the field of genetic engineering technology, and discloses a new method for xylanase secretion and expression in Escherichia coli. The signal peptide is fused to the N-terminal of the xylanase gene. At the C-terminal of the xylanase gene sequence, a codon encoding a histidine tag is added. The target gene nucleotide sequence Signal peptide Xylnase 6 X His is recovered from the PCR product, and the target gene is fused to the N-terminal of the xylanase gene. The correct recombinant expression vector was confirmed by sequencing in the cloned expression vector pET28a; the recombinant expression vector was transformed into E. coli strain; IPTG was added to the sample to induce the culture of the sample; and the high secretion expression of xylanase was realized. The xylanase can be secreted directly into the culture medium; compared with the original secretion expression of E. coli and yeast, the xylanase activity can be guaranteed to be high, the operation is easier, the time is saved and the cost is lower.

【技术实现步骤摘要】
一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法
本专利技术属于基因工程
尤其涉及一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法。
技术介绍
目前，业内常用的现有技术是这样的：目前制备木聚糖酶的方法主要有两类:一类大肠杆菌胞内表达，将目的基因克隆进大肠杆菌常用表达载体pET28a、pET26b中进行常规胞内表达，其需要复杂的细菌破碎和纯化方法的步骤，同时无法避免由于物理作用对木聚糖酶的活性低纯度低等问题，因此现有的研究成果均不建议在大肠杆菌中进行木聚糖酶的表达；另一类是毕赤酵母或酿酒酵母分泌表达，酵母细胞具有培养周期长，生长培养基复杂，生长环境十分严格等特点，一般的表达周期需要至少需要5天以上，此外毕赤酵母的生长pH一般需要严格控制在5.5-6.0左右，这将非常不利于碱性木聚糖酶在毕赤酵母中的表达。木聚糖是植物半纤维素的主要成分，约占植物细胞干重的15％-30％，是除纤维素之外自然界中最为丰富的多聚糖，也是自然界中最为重要的可再生资源之一。木聚糖的降解利用需要丰富的木聚糖水解酶系中各种酶相互之间协同完成，而其中木聚糖酶是其中最关键的水解酶。同时，木聚糖酶因为其优异的水解多聚糖为低聚糖的特性，使其在造纸、生物能源、食品、饲料工业等行业中具有广阔的应用前景。此外，工业中木聚糖酶大规模生物应用可以减少传统化学处理方法造成的环境污染。为了扩大木聚糖酶在工业中的应用，其中一个关键因素是开发一种低成本，省时，高产的生产方法。由于大肠杆菌易于操作，快速生长和培养成本极低的特性，若是能解决胞内表达产量低，木聚糖酶的活性低纯度低等问题，将会是理想的木聚糖酶异源表达宿主细胞。因而，开发木聚糖酶的分泌表达策略将有利于工业中木聚糖酶的大规模生物生产，其不需要细胞裂解步骤并避免了细胞裂解造成的复杂内源蛋白释放和活性降低的影响。综上所述，现有技术存在的问题是：(1)现有技术中，木聚糖酶的异源表达通过毕赤酵母或酿酒酵母分泌表达，大肠杆菌胞内表达。酵母细胞具有培养周期长，生长培养基复杂，生长环境十分严格等特点，表达周期需要至少需要5天以上，；对于大肠杆菌胞内表达，需要复杂的细菌破碎和纯化方法的步骤，无法避免由于物理作用对木聚糖酶的活性低纯度低等问题。(2)木聚糖酶需要维持正确的蛋白结构以维持较高的酶活活性，同时对于碱性木聚糖酶而言需要更高的pH条件来保证高活性蛋白酶的表达，因此需要在简单易操作的宿主中寻求更优化的表达条件。(3)目前为止对于木聚糖酶生产还没有大肠杆菌分泌表达的更多报道，大肠杆菌周质空间的大量分子伴侣可在分泌途径中有效地协助分泌蛋白正确折叠，因而，因此对于建立一个新的表达系统，需要从其本身性质出发考虑选择，设法发掘到有效的信号肽帮助其在大肠杆菌中的分泌。解决上述技术问题的难度和意义：木聚糖酶在医药、食品、造纸、动物饲养等工业中均应用广泛，开发使用大肠杆菌等原核表达系统并进行大规模生产可以大幅度缩短实践应用中的生产时间以及减少生产成本，进而提高工作效率。
技术实现思路
针对现有技术存在的问题，本专利技术提供了一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法。本专利技术是这样实现的，一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，所述在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法包括：第一步，获取所需木聚糖酶基因，从多种信号肽的氨基酸序列SEQIDNO：1～SEQIDNO：7合成得到不同的信号肽的序列SEQIDNO：7～SEQIDNO：14；第二步，通过融合PCR的方式将信号肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同时木聚糖酶基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子SEQIDNO：15，PCR产物回收得到，核苷酸序列Signalpeptide-Xylnase-6×His；第三步，将第二步的核苷酸序列SEQIDNO：16～SEQIDNO：23Signalpeptide-Xylnase-6×His克隆到大肠杆菌表达载体pET28aSEQIDNO：24中,测序确认得到正确的重组表达载体(该测序正确的表达载体对应于使用pET28a的通用引物T7/T7-TER测序后，得到SEQIDNO：16～SEQIDNO：23对应的正确表达框)；第四步，将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3)菌株(购买于美国英杰公司(Carlsbad,CA,USA))；第五步，分别挑取转化成功的单克隆表达菌株(为上述大肠杆菌BL21(DE3)菌株转化了表达载体的重组菌株。)接种于2mlLB培养基中过夜培养，12-14h；第六步，分别将过夜培养的菌液接种于含有50mlLB培养基的培养瓶中，培养；第七步，向样品中添加IPTG，样品诱导培养；实现木聚糖酶的高效分泌表达；第八步，诱导完成的样品，离心，收集上清得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。进一步，第二步中，融合PCR为通过20bp的同源臂将片段A和片段B连接形成一个AB片段的酶链式聚合反应；第四步中，转化为将DNA导入有机体使得该DNA作为染色体外的元件复制。进一步，第六步中，将过夜培养的菌液以1:100的比列接种于含有50mlLB培养基的培养瓶中，37度培养至OD600＝0.6-0.8；第七步中，向样品中添加终浓度为0.5mM的IPTG，将样品置于18℃诱导培养20h。第八步中，诱导完成的样品在17000rmp,4℃条件下离心10min，收集上清得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。进一步，第八步中，收集得到的木聚糖酶粗酶液直接用于使用SDS-PAGE检测，浓度和活性分析，同时直接使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到纯蛋白。进一步，第三步中，碱性木聚糖酶XynHB大肠杆菌分泌表达载体的构建包括：1)碱性木聚糖酶XynHB来源于枯草芽孢杆菌HBP8，并且去除自身N端的27个氨基酸信号肽的成熟形式；2)通过在木聚糖酶成熟XynHB中N端融合可促进蛋白质进行胞外分泌的信号肽；3)信号肽包括表征良好的来源于Sec途径的信号肽OmpA、PelB、PhoA、Lpp,Tat途径的信号肽TorA、Fdog,以及来源于Sec-Tat途径的的信号肽FhuD；4)根据大肠杆菌密码子偏好表得到分别对应于各个信号肽的基因序列，同时在信号肽C末端添加和XynHB同源的20bp用于融合PCR；5)片段Signalpeptide-Xylnase-6×His的制备；6)用NcoI和XhoI对载体pET28a和连接产物进行双酶切，酶切反应于37℃下进行6h，切胶回收目的片段，用DNA纯化试剂盒回收经NcoI和XhoI线性化的载体和目的片段；7)根据各片段的回收情况确定连接体系，用T4DNA连接酶在16℃过夜连接；8)将10ul的连接产物转化到克隆宿主XL-Gold中，次日对单菌落进行菌落PCR验证，正确的转化子提质粒酶切，并测序验证重组表达载体构建成功。进一步，步骤5)片段Signalpeptide-Xylnase-6×His的制备，具体包括：融合PCR反应体系(100μL):Pfu4μL，模板A+B＝20～30ng(根据两个片段的实际浓度，以摩尔币为1:1计算片段Signalpeptide和XynHB的添加量)，上下游引物各3μL，KODbuffer10ul,dNTP4μL,灭菌的ddH2O定溶至100μL；PCR扩增条件:95℃预变性3min；94℃变性30s，57℃退本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，所述在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法包括：第一步，获取所需木聚糖酶基因，从多种信号肽的氨基酸序列SEQ ID NO：1～SEQ ID NO：7合成得到不同的信号肽的核苷酸序列SEQ ID NO：7～SEQ ID NO：14；第二步，通过融合PCR的方式将信号肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同时木聚糖酶基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子，PCR产物回收得到核苷酸序列Signal peptide‑Xylnase‑6×His；第三步，将第二步的核苷酸序列Signal peptide‑Xylnase‑6×His克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,测序确认得到正确的重组表达载体；第四步，将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21菌株；第五步，分别挑取转化成功的单克隆表达菌株接种于2ml LB培养基中过夜培养，12‑14h；第六步，分别将过夜培养的菌液接种于含有50ml LB培养基的培养瓶中，培养；第七步，向样品中添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养；实现木聚糖酶的高效分泌表达；第八步，诱导完成的样品，离心，收集上清得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。...

【技术特征摘要】
1.一种在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，所述在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法包括：第一步，获取所需木聚糖酶基因，从多种信号肽的氨基酸序列SEQIDNO：1～SEQIDNO：7合成得到不同的信号肽的核苷酸序列SEQIDNO：7～SEQIDNO：14；第二步，通过融合PCR的方式将信号肽融合于木聚糖酶基因的N末端，同时木聚糖酶基因序列的C端添加编码组氨酸标签的密码子，PCR产物回收得到核苷酸序列Signalpeptide-Xylnase-6×His；第三步，将第二步的核苷酸序列Signalpeptide-Xylnase-6×His克隆到大肠杆菌表达载体pET28a中,测序确认得到正确的重组表达载体；第四步，将重组表达载体转化至大肠杆菌BL21菌株；第五步，分别挑取转化成功的单克隆表达菌株接种于2mlLB培养基中过夜培养，12-14h；第六步，分别将过夜培养的菌液接种于含有50mlLB培养基的培养瓶中，培养；第七步，向样品中添加终浓度为0.5mM的IPTG诱导培养；实现木聚糖酶的高效分泌表达；第八步，诱导完成的样品，离心，收集上清得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。2.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，第二步中，融合PCR为通过20bp的同源臂将片段A和片段B连接形成一个AB片段的酶链式聚合反应；第四步中，转化为将DNA导入有机体使得该DNA作为染色体外的元件复制。3.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，第六步中，将过夜培养的菌液以1:100的比列接种于含有50mlLB培养基的培养瓶中，37度培养至OD600＝0.6-0.8；第七步中，向样品中添加终浓度为0.5mM的IPTG，将样品置于18℃诱导培养20h。第八步中，诱导完成的样品在17000rmp,4℃条件下离心10min，收集上清得到分泌在培养基中的木聚糖酶样品。4.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新方法，其特征在于，第八步中，收集得到的木聚糖酶粗酶液直接用于使用SDS-PAGE检测，浓度和活性分析，同时直接使用镍离子亲和层析柱进行纯化得到纯蛋白。5.如权利要求1所述的在大肠杆菌中进行木聚糖酶分泌表达的新...

【专利技术属性】
技术研发人员：易犁，张发英，何华华，喻婵，
申请(专利权)人：湖北大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42