一种以杂多糖为碳源生产内切β-1,3-葡聚糖酶的方法技术

本发明专利技术公开了本发明专利技术涉及一种以杂多糖为碳源生产内切β‑1,3‑葡聚糖酶的方法，属于发酵工程技术领域。本发明专利技术采用高果糖浆废液杂多糖代替葡萄糖利用毕赤酵母工程菌PGAP9K‑BGN13.1生产内切β‑1,3‑葡聚糖酶，为高果糖浆废液杂多糖提供了其在生物工程领域的价值，与葡萄糖做碳源相比，本发明专利技术的所述杂多糖做碳源发酵效果在相差无几的同时，发酵成本显著降低。

A Method for Producing Endogenous Beta-1,3-glucanase Using Heteropolysaccharide as Carbon Source

The invention discloses a method for producing endoglucanase using heteropolysaccharide as carbon source, belonging to the field of fermentation engineering technology. The invention adopts high fructose syrup waste liquor heteropolysaccharide instead of glucose to produce endo-cut beta 1,3-glucanase by Pichia pastoris engineering strain PGAP9K BGN13.1, which provides the heteropolysaccharide of high fructose syrup waste liquor with its value in the field of bioengineering. Compared with glucose as carbon source, the heteropolysaccharide of the invention has similar fermentation effect as carbon source, while the fermentation cost is significantly reduced.

【技术实现步骤摘要】
一种以杂多糖为碳源生产内切β-1,3-葡聚糖酶的方法
本专利技术涉及一种以杂多糖为碳源生产内切β-1,3-葡聚糖酶的方法，属于发酵工程

技术介绍
高果糖浆作为一种新型甜味剂具有低热量、低生产成本及工艺简便等优点，每年都有巨大的产量。高果糖浆是以淀粉为原料，由生物工程技术生产而来。其主要步骤有液化、糖化、离子交换、浓缩、异构化及果葡分离等。经过最后一步果葡分离后，高果糖浆作为产品包装售卖，剩余的废液杂多糖中含有大量的葡萄糖、果糖及少量的寡糖。但废液价格十分低廉且售卖领域十分有限。β-1,3-葡聚寡糖是一类重要的生理活性物质，其应用范围近年来逐渐扩大，如β-1,3-葡聚寡糖可以通过刺激宿主免疫功能，激活巨噬细胞、中性粒细胞和天然杀伤细胞而具有抗菌抗肿瘤活性。目前制备β-1,3-葡聚寡糖的主要方法是水解β-1,3-葡聚多糖。使用专一性内切酶水解多糖制备相应寡糖优势明显。内切β-1,3-葡聚糖酶能够沿分子链随机切割β-1,3-糖苷键，产生DP2-10的寡糖。该类酶来源广泛，存在于植物、真菌以及细菌中。除此之外，内切β-1,3-葡聚糖酶在细胞融合和转化、原生质体制备、食品加工、药物筛选、饲料加工和发酵工业生产方面也有着巨大的潜在应用。
技术实现思路
本专利技术使用高果糖浆废液杂多糖代替葡萄糖作为毕赤酵母工程菌PGAP9K-BGN13.1生产内切β-1,3-葡聚糖酶的碳源，以降低发酵成本。本专利技术的第一个目的是提供一种生产内切β-1,3-葡聚糖酶的方法，以杂多糖或含有杂多糖的组合物为碳源，以毕赤酵母为发酵微生物，生产内切β-1,3-葡聚糖酶。在本专利技术的一种实施方式中，所述含有杂多糖的组合物为高果糖浆废液。在本专利技术的一种实施方式中，所述高果糖浆废液含有聚合度2-17的线性葡聚糖，单糖部分包括葡萄糖和果糖；其中总糖含量为902.3g/L±50g/L，葡萄糖含量为480g/L±30g/L，果糖含量为292g/L±20g/L，麦芽糖含量为103.6g/L±10g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵培养基含有酵母粉、蛋白胨、KH2PO4、K2SO4、MgSO4、(NH4)2SO4、柠檬酸、CaSO4和PTM1。在本专利技术的一种实施方式中，发酵培养基中，酵母粉的浓度为10g/L，蛋白胨的浓度为20g/L，KH2PO4的浓度为14.3g/L，K2SO4的浓度为4.77g/L，MgSO4的浓度为5.7g/L，(NH4)2SO4的浓度为5g/L，柠檬酸的浓度为1.92g/L，CaSO4的浓度为0.1g/L，PTM1的浓度为4.8mL/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵过程还进行补料。在本专利技术的一种实施方式中，补料的培养基含有：杂多糖、酵母粉、蛋白胨。在本专利技术的一种实施方式中，补料的培养基中，杂多糖浓度为20-60g/L。在本专利技术的一种实施方式中，补料的培养基中，杂多糖浓度为500g/L，酵母粉浓度为10g/L，蛋白胨浓度为20g/L。在本专利技术的一种实施方式中，所述发酵包括以下步骤：1)使用固体培养基对毕赤酵母进行活化，得到活化后的单菌落；2)使用种子培养基对步骤1)得到的单菌落进行摇瓶培养，得到处于对数生长期(OD600值在2-3)的菌悬液；3)在7L发酵罐中装入3.4L所述发酵培养基，接入发酵罐控制系统，平衡各种控制参数至少2h；4)将步骤2)所得菌种悬浮液接入发酵罐中进行发酵培养，一定时间后，流加补料培养基，培养时间为接种后120h；5)步骤4)完成后，取发酵上清液即可获得内切β-1,3-葡聚糖酶粗酶液。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤1)中固体培养基为YPD固体培养基；活化时间为2-3天，活化次数为2次。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤2)中种子培养基为YPD液体培养基，摇瓶培养时间为16-20h，转速为220r/min，温度为30℃。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤3)中，所述控制参数分别为：pH，DO，转速，温度，通气量。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤3)中，所述控制参数值分别为：pH7.0,DO≥30，转速200-800r/min,温度30℃，通气量2-6。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤3)中，所述pH通过流加30％的H3PO4及40％的NH4OH进行调控。在本专利技术的一种实施方式中，所述步骤4)中，所述接种菌种悬浮液为接种OD600在2-3的对数生长期菌株600mL。在本专利技术的一种实施方式中，步骤4)中所述一定时间是发酵培养基中葡萄糖消耗完毕后2h。在本专利技术的一种实施方式中，所述补料培养基的流加速度为3mL/L/h。在本专利技术的一种实施方式中，所述毕赤酵母为毕赤酵母PGAP9K-BGN13.1的构建方法记载于2019年1月公开的《土壤杆菌-毕赤酵母耦合培养直接生产热凝胶低聚糖》论文中。本专利技术还要求保护所述方法在细胞融合和转化、原生质体制备、食品加工、药物筛选、饲料加工和发酵工业生产等方面的应用。本专利技术的有益效果：生物发酵过程绝大多数的碳源都是葡萄糖，且每批发酵葡萄糖的用量很大，导致发酵过程中碳源成本高昂。本专利技术采用高果糖浆废液杂多糖代替葡萄糖利用毕赤酵母工程菌PGAP9K-BGN13.1生产内切β-1,3-葡聚糖酶，为高果糖浆废液杂多糖提供了其在生物工程领域的价值，与葡萄糖做碳源相比，本专利技术的所述杂多糖做碳源发酵效果在相差无几的同时，碳源成本降低了40倍。具体实施方式在本专利技术中，不做特别说明的情况下，杂多糖指代高果糖浆废液，其成分为：聚合度2-17的线性单糖；单糖包括葡萄糖和果糖，其中总糖含量为902.3g/L，葡萄糖含量为480g/L，果糖含量为292g/L，麦芽糖含量为103.6g/L。生物量测定方法：使用分光光度计在600nm下测定吸光度(OD600)值，根据曲线DCW＝0.34OD600计算细胞干重。酶活测定方法：本研究中内切β-1,3-葡聚糖酶活力定义为：以热凝胶为底物，水解反应1分钟生成1μg寡糖所需的酶量定义为一个酶活单位(U)。反应体系5mL，包含1.5mL2％(w/v)热凝胶悬浮液，2.5mL醋酸钠缓冲液(0.025mol·L-1，PH6.0)，1mL毕赤酵母发酵液上清，反应液置于50℃水浴2.5h反应结束后沸水浴加热10min终止反应。随后，水解液中寡糖含量采用TLC板法测定。实施例1培养基配方：发酵初始培养基：杂多糖40g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L，KH2PO414.3g/L，K2SO44.77g/L，MgSO45.7g/L，(NH4)2SO45g/L，柠檬酸1.92g/L，CaSO40.1g/L，PTM14.8mL/L杂多糖流加培养基：杂多糖500g/L，酵母粉10g/L，蛋白胨20g/L。1)使用YPD固体培养基对工程菌毕赤酵母PGAP9K-BGN13.1进行活化，活化时间2-3天，活化次数2次，得到活化后的单菌落；2)使用种子培养基YPD液体培养基对步骤1)得到的单菌落进行摇瓶培养16-20h,转速为220r/min，温度为30℃，得到处于对数生长期(OD600＝3)的菌悬液；3)在7L发酵罐中装入3.4L本专利技术所述杂多糖发酵初始培养基，接入发酵罐控制系统，平衡各种控制参数至少2h，各参数指标为pH7.0,为保证DO≥30，转速调节范围为200-80本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产内切β‑1,3‑葡聚糖酶的方法，其特征在于，以杂多糖或含有杂多糖的组合物为碳源，以毕赤酵母为发酵微生物，生产内切β‑1,3‑葡聚糖酶。

【技术特征摘要】
1.一种生产内切β-1,3-葡聚糖酶的方法，其特征在于，以杂多糖或含有杂多糖的组合物为碳源，以毕赤酵母为发酵微生物，生产内切β-1,3-葡聚糖酶。2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述含有杂多糖的组合物为高果糖浆废液。3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述高果糖浆废液含有聚合度2～17的线性葡聚糖，单糖部分包括葡萄糖和果糖；其中总糖含量为902.3g/L±50g/L，葡萄糖含量为480g/L±30g/L，果糖含量为292g/L±20g/L，麦芽糖含量为103.6g/L±10g/L。4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，发酵用的培养基中含有酵母粉、蛋白胨、KH2PO4、K2SO4、MgSO4、(NH4)2SO4、柠檬酸...

【专利技术属性】
技术研发人员：高敏杰，詹晓北，朱莉，蒋芸，吴剑荣，张洪涛，刘丽萍，李志涛，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32