一种新的牛肠源溶菌酶蛋白的DNA序列及其生产工艺和应用制造技术

本发明专利技术属于生物医药和基因工程技术领域，涉及一种生产牛肠源溶菌酶蛋白的新的DNA序列。更具体的本发明专利技术提供了一种产生具有牛肠源溶菌酶蛋白活性的多肽的方法,将含有核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的DNA可操作地连于表达调控序列,形成牛肠源溶菌酶蛋白表达载体；表达、分离出具有牛肠源溶菌酶活性的蛋白。使用该方法生产的牛肠源溶菌酶其溶菌酶活性较高，同时应用本发明专利技术的生产方法分离纯化步骤简单易行，为牛肠源溶菌酶蛋白的工业化生产提供了一个高效的生产工艺。针对目前市场上的溶菌酶蛋白大部分来源于从鸡蛋中提取的鸡源溶菌酶，本发明专利技术的重组牛肠源溶菌酶具有成本低、安全性高等优势。

DNA Sequence of a New Bovine Enteric Lysozyme Protein and Its Production Technology and Application

The invention belongs to the field of biomedicine and gene engineering technology, and relates to a new DNA sequence for producing bovine enteric lysozyme protein. More specifically, the present invention provides a method for producing polypeptide with bovine intestinal lysozyme protein activity. DNA containing nucleotide sequence such as SEQ ID N0:3 can be operatively linked to expression regulation sequence to form bovine intestinal lysozyme protein expression vector, and protein with bovine intestinal lysozyme activity can be expressed and isolated. The bovine intestinal lysozyme produced by the method has higher lysozyme activity, and the separation and purification steps by the production method of the invention are simple and feasible, thus providing an efficient production process for industrialized production of bovine intestinal lysozyme protein. The recombinant bovine intestinal lysozyme has the advantages of low cost and high safety.

【技术实现步骤摘要】
一种新的牛肠源溶菌酶蛋白的DNA序列及其生产工艺和应用
本专利技术属于生物医药和基因工程
,具体涉及一种用牛肠源溶菌酶编码核苷酸生产牛肠源溶菌酶蛋白的方法,本专利技术还涉及用上述工艺生产牛肠源溶菌酶所需的载体、重组质粒、宿主细胞、获得的牛肠源溶菌酶蛋白蛋白产物及该生产方法的应用。
技术介绍
现有技术公开了溶菌酶(Lysozyme，EC3.2.1.17)广泛存在于鸟类和家禽的蛋清中，亦存在于哺乳动物的泪液、唾液、血浆、乳汁、胎盘、体液及组织细胞内，其中以蛋清中含量最丰富。溶菌酶对革兰氏阳性菌有抗菌作用，而对没有细胞壁的动物体细胞不会产生不利影响，因而安全性很高。口服溶菌酶，可阻止流感和腺病毒繁殖。作为抗生素的替代品，溶菌酶被WHO和许多国家认定为无毒、无害、安全的，可以应用于食品和饲料添加剂领域，2010年被我国卫生部批准为食品添加剂。研究显示，溶菌酶具有抗菌消炎、抗病毒、增强机体免疫力和抑菌作用。细菌的细胞壁由胞壁质组成，胞壁质是由N一乙酰氨基葡萄糖及N一乙酰胞壁酸交替组成的多聚物，胞壁酸残基上可以连接多肽，称为肽聚糖。溶菌酶能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖，降低细菌细胞壁的稳定性，随后细菌因细胞内外渗透压不平衡而引起细胞破裂、细胞质外泄，最终导致菌体细胞死亡。溶菌酶能与带负电荷的病毒蛋白直接作用，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复合盐使侵人体内的病毒失去活性。溶菌酶作为机体非特异性免疫因子之一，参与机体多种免疫反应，在机体正常防御功能和非特异免疫中，具有保持机体生理平衡的重要作用。溶菌酶能专一性作用于目的微生物细胞壁。该酶有较宽抑菌谱，对革兰阳性菌(金黄色葡萄球菌、藤黄微球菌、枯草芽孢杆菌等)和养殖中常见致病菌(鸡大肠埃希菌、鳗弧菌、副溶血弧菌等)都有较强杀灭作用。据报道，用0.05％溶菌酶与聚合磷酸盐和甘氨酸等配合使用，具有良好防腐作用，在饲料中添加溶菌酶可防止霉变，延长饲料贮存期，减少损耗。溶菌酶用于饲料中，与葡萄糖氧化酶有增效作用。抗酸作用还可加入花生四烯酸。如果将溶菌酶与乳酸链球菌素、卵运铁蛋白、葡聚糖、甘氨酸或EDTA等结合使用，则对抑制或杀灭单核细胞增生李氏菌、大肠杆菌、普通变形杆菌、副溶血孤菌等也有显著作用。研究还发现，溶菌酶对仔猪腹泻有防治作用。邵春容等报道，仔猪饲喂溶菌酶制剂，腹泻率显著降低，对引起仔猪腹泻的埃希氏大肠杆菌和轮状病毒有较强的抑制作用，表明溶菌酶能有效维持仔猪肠道健康的功能。研究同时还发现，溶菌酶具有多种药理作用，它可与各种诱发炎症的酸性物质结合，使其失活，并能增强机体的免疫力，改善组织基质的粘多糖代谢，从而达到消炎，修复组织，改善胃肠道功能的目的。溶菌酶本身是一种天然蛋白质，无毒性，是一种安全性高的饲料添加剂。溶菌酶可促进饲料中营养物质的消化、吸收，最大限度地提高饲料的利用率。大量研究与应用表明，在饲料中添加溶菌酶，可以有效提高动物的生长性能，预防疾病的发生，尤其是防治仔猪腹泻，提高机体免疫机能，提高动物健康效果显著。因此，溶菌酶作为一种安全高效的绿色添加剂，在目前食品安全越来越受重视的背景下，将在畜牧生产中发挥越来越重要的作用。目前市场上的溶菌酶蛋白大部分来源于从鸡蛋提取鸡源溶菌酶,但是，动物在进化过程中，其内在溶菌酶基因各有特点，以适应各种动物的需要，例如牛中某些表达的溶菌酶蛋白就对胃蛋白酶的消化有拮抗作用(NonakaY,FEBSJ.276(8),2192-2200(2009))。关于溶菌酶的分子进化的研究也引起了人们的关注(MEIYU，MOLECULARPHYLOGENETICSANDEVOLUTIONVol.5,No.2,April,pp.298–308,1996)，不同物种的溶菌酶的功能始终与不同物种的生活环境，生理特性相适应。猪源的溶菌酶，和牛溶菌酶，与鸡源溶菌酶等蛋白序列不同，功能也各有特点。同时相对从鸡蛋提取的鸡源溶菌酶，重组源溶菌酶具有成本低、安全性高等优势。基于现有技术的现状，本申请的专利技术人拟提供一种新的牛肠源溶菌酶蛋白的DNA序列及其生产工艺和应用。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种新的核苷酸序列,该核酸被命名为牛肠源溶菌酶蛋白DNA序列(LYC-COW)。本专利技术的另一个目的是提供一种用上述核苷酸序列生产牛肠源溶菌酶蛋白的方法。本专利技术的再一个目的是提供一种重组体,该载体含有牛肠源溶菌酶蛋白DNA序列(LYC-COW)核酸序列并可以通过转化宿主实施,如大肠杆南、酵母细胞,表达出溶菌酶蛋白。本专利技术的再一个目的是提供一种宿主细胞,该细胞含有能表达牛肠源溶菌酶蛋白的DNA序列(LYC-COW)的重组质粒并可表达具有溶菌酶活性的蛋白。本专利技术还提供了这种生产方法以及用该方法生产出的溶菌酶蛋白的应用。在本专利技术的一个方面,提供了一种用LYC-COW核苷酸序列生产具有牛肠源溶菌酶活性蛋白的方法,该方法包括:(1).将分高纯化的编码具有牛肠源溶菌酶蛋白活性多肽的核苷酸序列可操作地连于表达调控序列,形成牛肠源溶菌酶蛋白的表达载体；(2).将步聚(1)中的表达载体转入宿主细胞,筛选出表达牛肠源溶菌酶蛋白的重组细胞:(3).高密度培养步(2)中的重组细胞:(4).分离出具有牛肠源溶菌酶蛋白,并将其制成冻干粉。在本专利技术中,“分高的”、“纯化的”或“基本纯的”溶菌酶蛋自(或多肽)编码序列是指,该序列或片段已从天然状态下位于其两边的序列中分离出来,还指该序列或片段已经与天然状态下伴随核酸的组份分开,而且已经与在细胞中伴随其的蛋白质分开。在本专利技术中,术语“溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有溶菌酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列,如SEQIDNO.1中核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指,位于SEQIDNO.1序列的编码框核苷酸中,有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性,所以与SEQIDNO.1中核苷酸序列同源性低至约92％的简并序列也能编码出SEQIDNO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQIDNO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列,更佳地能在高度严紧条件下与SEQIDNO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外,该术语还包括与SEQIDNO.1中核苷酸序列的同源性至少92％的核苷酸序列。该术语还包括能编码具有与牛肠源溶菌酶相同功能的蛋白的、SEQIDNO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若干个(通常为1_90个,较佳地1_60个,更佳地1-20个,最佳地1-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代,以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内,较佳地为30个以内,更佳地为10个以内,最佳地为5个以内)核苷酸。获得上述溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列,可以通过人工化学合成、从现存的DNA库扩增、从含有该序列的细胞、组织、器官中分离纯化得到。在本专利技术中,可选用本领域已知的各种载体,如市售的载体。在本专利技术中,术语“宿主细胞”包括原核细胞和真核细胞。常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。常用的真核宿主细胞包括酵母细胞,昆虫细胞、和哺乳动物细胞等。在本专利技术中LYC-COW的表达载体是按下述方法获得的:首先,根据SEQIDNO1所述核苷酸序列及表达蛋白所使用的载体pPIC9序列,合成本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产具有牛肠源溶菌酶蛋白活性的多肽的方法,其特征在于该方法包括如下步骤:(a)将含有核苷酸序列如SEQ ID N0:3所示的DNA可操作地连于表达调控序列,形成牛肠源溶菌酶蛋白表达载体；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞,筛选出表达牛肠源溶菌酶蛋白的重组细胞,其中所述宿主细胞为甲醇酵母；(c)高密度培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有牛肠源溶菌酶活性的蛋白。

【技术特征摘要】
1.一种生产具有牛肠源溶菌酶蛋白活性的多肽的方法,其特征在于该方法包括如下步骤:(a)将含有核苷酸序列如SEQIDN0:3所示的DNA可操作地连于表达调控序列,形成牛肠源溶菌酶蛋白表达载体；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞,筛选出表达牛肠源溶菌酶蛋白的重组细胞,其中所述宿主细胞为甲醇酵母；(c)高密度培养步骤(b)中的重组细胞；(d)分离出具有牛肠源溶菌酶活性的蛋白。2.如权利要求1所述的方法,其特征在于，该方法包括将分离出具有牛肠源溶菌酶活性的蛋白制成冻干粉。3.如权利要求1所述的方法,其特征在于，所使用的DNA序列如SEQIDN0:1所示。4.一种分离出的DN...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱幼惠，
申请(专利权)人：上海复华兴生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31