一种人源溶菌酶蛋白LYC8及其生产工艺和应用制造技术

本发明专利技术属基因工程领域,涉及生产人溶菌酶的新方法。本发明专利技术基于目前市场上的溶菌酶蛋白来源于其他种属动物机体,对人体而言是异种蛋白,有很强的抗原性,副作用大的现状，提供了生产人溶菌酶的新方法，该方法能在酵母中高效表达人体中的溶菌酶蛋白,解决异源性溶菌酶用于人体内的抗原性问题；同时本发明专利技术涉及的人源溶菌酶其溶菌酶活性较高,并可使用相对简单的分离纯化步骤。本发明专利技术还提供了一种产生具有人溶菌酶蛋白活性的多肽的方法,包括如下步骤:将SEQ ID N0:1所示序列连于表达调控序列,然后转入宿主细胞,筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞；随后高密度培养。本发明专利技术还涉及上述方法的产物及其应用。

A Human Lysozyme Protein LYC8 and Its Production Technology and Application

The invention belongs to the field of genetic engineering and relates to a new method for producing human lysozyme. The present invention provides a new method for producing human lysozyme based on the present situation that the lysozyme protein in the market originates from animal organisms of other species and has strong antigenicity and side effects for human body. The method can efficiently express human lysozyme protein in yeast and solve the antigenicity problem of heterologous lysozyme used in human body. Human lysozyme has higher lysozyme activity and can be purified by relatively simple steps. The invention also provides a method for producing polypeptides with human lysozyme protein activity, including the following steps: connecting the SEQ ID N0:1 sequence to the expression regulation sequence, then transferring to the host cell, screening out the recombinant cells expressing human lysozyme protein, and subsequently high-density culture. The invention also relates to the product of the above method and its application.

【技术实现步骤摘要】
一种人源溶菌酶蛋白LYC8及其生产工艺和应用
本专利技术属基因工程领域,涉及一种用新的核苷酸序列(LYC8)生产人溶菌酶蛋白的方法,本专利技术还涉及用上述工艺生产人溶菌酶所需的载体、重组质粒、宿主细胞、获得的人溶菌酶蛋白蛋白产物及该生产方法的应用。
技术介绍
感染性疾病一直是人类健康和生命的主要威胁，目前对于细菌性感染，抗生素及人工合成抗菌药物仍是最主要的治疗手段。然而进入21世纪后，不断出现的多重耐药细菌使感染性疾病的治疗困难重重，如甲氧西林耐药金黄色葡萄球菌(MRSA)、万古霉素耐药肠球菌(VRE)、青霉素耐药肺炎链球菌(PRSP)、泛耐药(PDR)铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌等各种超级耐药细菌的出现。因此寻找和开发与传统抗生素结构与作用机制以及作用靶位不同的抗菌药物已是当务之急。溶菌酶(Lysozyme)是一种水解酶，它能够水解细菌细胞壁中肽聚糖的糖苷键，又称胞壁质酶。该酶作用机理是切断肽聚糖中N-乙酰胞壁酸(NAM)与N-乙酰葡萄糖胺(NAG)之间的β-1，4-糖苷键之间的联结，破坏肽聚糖支架，在内部渗透压的作用下细胞胀裂开，引起细菌裂解。溶菌酶在自然界中分布广泛，按照溶菌酶的不同物种来源，可分为：鸡型(c-型，chickentype)、鹅型(g-型，goosetype)、无脊椎动物型(i-型，invertebratetype)、噬菌体溶菌酶、植物溶菌酶和细菌溶菌酶。在人体中同时存在鸡型和鹅型，也就是常说的c-型和g-型两种溶菌酶，其中c-型溶菌酶的研究最为广泛，因为它是唯一同时在脊椎动物、无脊椎动物和原索动物中存在的。c-型溶菌酶是大部分脊柱动物(包括哺乳动物)产生的主要溶菌酶，是作为酶结构和功能研究模型的原型溶菌酶。溶菌酶是一种具有杀菌作用的天然物质，它具有耐热、耐酸的理化特性，可溶于水、乙醇、油脂类溶剂，通过裂解细胞壁而达到裂解革兰氏阳性细菌的效果。对溶菌酶杀菌能力研究表明：极微量的溶菌酶即可杀灭溶壁微球菌、藤黄球菌、巨大芽孢杆菌、棒状杆菌、乳酸杆菌、细球菌、八迭球菌、葡萄球菌等自然界常见细菌。目前市场上的溶菌酶产品大多以蛋清溶菌酶为主要原料，因为鸡蛋清溶菌酶的提取工艺相对成熟，价格便宜，如上世纪80年代初上市的溶菌酶肠溶片、含片，我国SFDA已下达多个个鸡溶菌酶肠溶片生产文号、和含片生产文号。鸡溶菌酶产品在广州、上海、杭州的用量较大。除了应用在医药行业，鸡溶菌酶在日化行业也得到了应用，如口腔护理产品牙膏、漱口液、喷剂，化妆品等。但是，鸡蛋清溶菌酶对于人体而言是一种异源蛋白，在蛋白质一级结构上与人溶菌酶有较大差异，因此，它具有明显的局限性。鸡溶菌酶用于过敏体质人群时，可引发过敏反应，严重者可导致死亡。另外，鸡溶菌酶在人体内会产生免疫原性与毒副作用，无法用于静脉用药，对于侵入机体内的细菌、病毒无法产生抑制和杀灭作用。由于鸡溶菌酶的局限性，人们开始更加关注人溶菌酶(humanlysozyme，)的研究和开发。人溶菌酶是在人奶汁中发现的抗菌剂之一，且广泛存在于人的体液、细胞和组织器官中，如脾脏，肺脏，肾脏，白细胞，血浆，唾液和眼泪等。我们可以从人奶、胎盘或尿液中少量提取人溶菌酶，但制备材料相当有限，制备成本非常高，因此在医药、日化、食品、饲料添加剂等行业都没得到广泛应用。人溶菌酶与其他来源的溶菌酶相比，有许多无法逾越的优势，人溶菌酶来源于人体，和人体具有天然相容性，不会产生任何副作用和免疫原性。当前有应用酵母细胞作为工程菌表达人源溶菌酶的研究报道，但一般人源溶菌酶原始DNA序列与酵母细胞的氨基酸密码子不相适应，导致表达效率很低，无工业化生产价值。本申请通过大量的理论研究和实验研究专利技术一个新的DNA序列(LYC8)，此段DNA序列(LYC8)能在酵母中编码产生人源溶菌酶蛋白，同时利用此段DNA序列(LYC8)能在酵母中高效表达人源溶菌酶蛋白。同时，在人体内，人有多种溶菌酶蛋白，可用基因工程重组表达的方法进行体外表达生产，但不同的表达序列(DNA序列和蛋白序列)在不同的真核表达体系，酵母表达体系，昆虫表达体系，CHO细胞表达体系中表达量差异巨大，而高效表达是人源溶菌酶生产的关键。
技术实现思路
本专利技术的一个目的是提供一种用DNA序列(LYC8)生产人溶菌酶蛋白的方法。本专利技术的另一个目的是提供一种新的核苷酸序列,该核苷酸被命名为人LYC8。本专利技术的再一个目的是提供一种重组裁体,该裁体含有人LYC8核酸序列并可以通过转化宿主细施,如大肠杆菌、酵母细胞,表达出溶菌酶蛋白。本专利技术的再一个目的是提供一种宿主细胞,该宿主细胞含有人LYC8核苷酸序列的重组质粒并可表达具有人溶菌酶活性的蛋白。在本专利技术的一个方面,提供了一种生产具有人溶菌酶活性蛋自的方法,该方法包括:(1)将分离纯化的编码人溶菌酶蛋白活性多肽的核苷酸序列(LYC8)可操作地连接于表达调控序列,形成人溶菌酶蛋白的表达载体；(2)将步聚(a)中的表达载体转入宿主细胞,筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞:(3)高密度培养步(b)中的重组细胞:本专利技术中,所述宿主细胞可以为酵母细胞。本专利技术中,所使用的核苷酸序列如SEQIDNO1或者SEQIDNO:3所示。本专利技术中,具有人溶菌酶活性蛋自的生产方法还包括从高密度培养的重组细胞中分离纯化出具有人溶菌酶活性的蛋白,甚至将其制成冻干粉。较好的，所述的高密度培养过程中添加甲醇；当溶解氧气浓度升高到45％时,开始泵入甲醇溶液,速度为2-3ml/升/小时；当溶解氧气浓度下降到30％后,提高甲醇速度至5-8ml/升/小时；当将解氧气浓度下降到20％时,提高甲醇速度至l0ml/升/小时。或者，所述的高密度培养过程中可以添加甘油，以19-25ml/小时/升的速度泵入甘油,时间是5-7小时，直至溶解氧气浓度低于20％时。另一方面,本专利技术提供了一种分离出的DNA分子,它编码具有人溶菌酶活性的蛋白且其序列为SEQIDNO:l所示。本专利技术提供了一种载体,它含有上述DNA。本专利技术还提供了一种宿主细胞，它含有上述DNA或者上述载体。较好的，该细胞为真核细胞。在本专利技术中,术语“溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列”指编码具有溶菌酶蛋白活性的多肽的核苷酸序列,如SEQIDNO.1中核苷酸序列及其简并序列。该简并序列是指,位于SEQIDNO.1序列的编码框核苷酸中,有一个或多个密码子被编码相同氨基酸的简并密码子所取代后而产生的序列。由于密码子的简并性,所以与SEQIDNO.1中核苷酸序列同源性低至约92％的简并序列也能编码出SEQIDNO.2所述的序列。该术语还包括能在中度严紧条件下与SEQIDNO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列,更佳地能在高度严紧条件下与SEQIDNO.1中核苷酸序列杂交的核苷酸序列。此外,该术语还包括与SEQIDNO.1中核苷酸序列的同源性至少92％的核酸序列。该术语还包括能编码具有与人溶菌酶相同功能的蛋白的SEQIDNO.1序列的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于):若千个(通常为1-90个,较佳地1-60个,更佳地1-20个,最佳地l-10个)核苷酸的缺失、插入和/或取代,以及在5'和/或3'端添加数个(通常为60个以内,较佳地为30个以内,更佳地为l0个以内,最佳地为5个以内)核苷酸。获得上述溶菌酶蛋白(或多肽)编码序列,可本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种生产具有人溶菌酶蛋白活性的多肽的方法,其特征在于，该方法包括如下步骤:(a)将SEQ ID N0:3所示核苷酸序列可操作地连于表达调控序列,形成人溶菌酶蛋白表达载体；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞,筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞；(c)高密度培养步骤(b)中的重组细胞。

【技术特征摘要】
1.一种生产具有人溶菌酶蛋白活性的多肽的方法,其特征在于，该方法包括如下步骤:(a)将SEQIDN0:3所示核苷酸序列可操作地连于表达调控序列,形成人溶菌酶蛋白表达载体；(b)将步骤(a)中的表达载体转入宿主细胞,筛选出表达人溶菌酶蛋白的重组细胞；(c)高密度培养步骤(b)中的重组细胞。2.如权利要求1的方法,其特征在于,其中所述宿主细胞为酵母细胞。3.如权利要求1的方法,其特征在于，所使用编码人源溶菌酶氨基酸序列的核苷酸序列如SEQIDN0:1所示。4.如权利要求1的方法,其特征在于，该方法包括从高密度培养的重组细胞中分离出具有人溶菌酶活性的蛋白,并将其制成冻干粉。5.如权利要求1的方法,其特征在于，所述的高密度培养过程中添...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱幼惠，
申请(专利权)人：上海复华兴生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31