The invention discloses a method for improving the production of lysozyme in poultry eggs by using gene editing technology. The method comprises the following steps: cloning targeted sgRNA containing targeted editing for the promoter region of avian lysozyme into V2 plasmid containing Cas9 gene with DNA double-strand splicing, and obtaining a plasmid editing for the promoter of avian lysozyme; constructing a gene editing template ssDNA, the model; Plate ssDNA is a linear ssDNA containing left homologous sequence of target complementary chain, 2000 BP ovalbumin transcription initiation complementary sequence and right homologous sequence of target complementary chain. The above-mentioned gene editing plasmid and gene editing template ssDNA are mixed to form a mixture of plasmid vectors and mixed with liposome to incubate near the blastocyst to obtain lysis containing high-efficiency promoters. Female Poultry Individuals with Bacterial Enzyme Gene. The method of the invention has the characteristics of reliable technology, permanent, safe and efficient expression, and the translation amount of lysozyme is increased by nearly 100 times.
【技术实现步骤摘要】
一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法
本专利技术属于家禽品种分子精确改良育种
,尤其涉及一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法。
技术介绍
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶,是一种从禽蛋蛋白中分离提取的能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。它能够通过破坏细菌细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键,使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽,导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解发挥灭菌效果。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合,与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐,使病毒失活抑制病毒扩增繁殖。因此,该酶具有抗菌、消炎、抗病毒等作用。因其广泛的抗菌和抗病毒的作用,又被称后抗生素时代的新型免疫因子,目前该新型免疫因子已经在医学领域、食品生产领域得到广泛应用及效果的验证。由于它主要来之动物体液是一种天然酶,安全绿色的添加剂,无抗药性,而且对没有细胞壁的人体细胞不会产生不利影响,特别适合于各种食品的防腐。另外,该酶还能杀死肠道腐败球菌,增加肠道抗感染力,同时还能促进婴儿肠道双歧乳酸杆菌增殖,促进乳酪蛋白凝乳利于消化,所以又是婴儿食品、饮料的良好添加剂。正因为溶菌酶对人体完全无毒、无副作用,具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效,是一种安全的天然防腐剂,因此有着广阔的应用前景,但由于利用生物工程技术生产的溶菌酶在生物活性等各方面与天然的溶菌酶活性存在较大差异,因此目前溶菌酶的主要来源还是家禽的蛋清、动物血液等体液提取为主,其中以家禽蛋清的含量最为丰富,活性最佳。目前一个鸡蛋可以提取的溶菌酶含量仅为3mg左右,按 ...
【技术保护点】
1.一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:(1)将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgRNA克隆到包含DNA双链剪切的Cas9基因的V2质粒中,得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒;(2)构建基因编辑模板ssDNA,该模板ssDNA为包含靶点互补链左侧同源序列、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssDNA;(3)将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssDNA混合制成质粒载体组混合液,并将混合液与脂质体混合抚育;(4)在体外孵化禽胚蛋的胚盘附近加入脂质体抚育后,把步骤(3)中抚育后的混合液注射到开始发育的囊胚附近,将整个胚蛋移至体外容器,加入双抗后用密封、孵化,在形成个体后对插入的片段进行验证筛选,获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。
【技术特征摘要】
1.一种利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:(1)将包含有针对禽溶菌酶启动子区域进行定点编辑的靶向sgRNA克隆到包含DNA双链剪切的Cas9基因的V2质粒中,得到针对禽溶菌酶启动子进行编辑的质粒;(2)构建基因编辑模板ssDNA,该模板ssDNA为包含靶点互补链左侧同源序列、2000bp卵清蛋白转录启动互补序列以及靶点互补链右侧同源序列的线状ssDNA;(3)将上述基因编辑质粒、基因编辑模板ssDNA混合制成质粒载体组混合液,并将混合液与脂质体混合抚育;(4)在体外孵化禽胚蛋的胚盘附近加入脂质体抚育后,把步骤(3)中抚育后的混合液注射到开始发育的囊胚附近,将整个胚蛋移至体外容器,加入双抗后用密封、孵化,在形成个体后对插入的片段进行验证筛选,获得含有高效启动子的溶菌酶基因的雌性家禽个体。2.如权利要求1所述的利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法,其特征在于,所述禽蛋为鸡蛋。3.如权利要求2所述的利用基因编辑技术提高禽蛋溶菌酶产量的方法,其特征在于,在步骤(1)中,鸡基因组的靶向sgRNA如SEQIDNO:1所示;在步骤(2)中,鸡基因组的靶点互补链左侧同源序列如SEQIDNO:2所示,鸡基因组的2000bp卵清蛋白转录启动互补序列如SEQIDNO:3所示,鸡基...
【专利技术属性】
技术研发人员:任晋东,卢立志,刘小林,俞奇力,刘雅丽,付永前,王文基,沈建良,杨福生,
申请(专利权)人:台州学院,浙江省农业科学院,西北农林科技大学,
类型:发明
国别省市:浙江,33
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