具提升酶活性的溶菌酶制造技术

本发明专利技术关于一种具提升酶活性的溶菌酶，其氨基酸序列为将序列编号2第166个位置的组氨酸突变成赖氨酸的序列。本发明专利技术提供的溶菌酶的活性明显高于野生型溶菌酶，进而降低了其生产成本并增加了此溶菌酶的工业应用价值。

Lysozyme with Enhanced Enzyme Activity

The present invention relates to a lysozyme with enzymatic activity promotion. The amino acid sequence of the lysozyme is a sequence that mutates histidine at position 166 of sequence number 2 into lysine. The activity of the lysozyme provided by the invention is obviously higher than that of the wild type lysozyme, thereby reducing the production cost and increasing the industrial application value of the lysozyme.

【技术实现步骤摘要】
具提升酶活性的溶菌酶
本专利技术系关于一种溶菌酶，尤指一种具提升酶活性的溶菌酶。
技术介绍
溶菌酶(Lysozyme,EC3.2.1.17)是一种作用于微生物细胞壁的水解酶，又称为胞壁质酶。它能有效地水解细菌细胞壁的肽聚糖(peptidoglycan)，其机制主要是透过水解N-乙酰胞壁酸(N-acetylmuramicacid)和N-乙酰葡萄糖胺(N-acetylglucosamine)之间的β-1,4糖苷键，使肽聚糖骨架结构断裂后造成细胞壁破裂，最终导致细菌溶解。溶菌酶广泛存在于自然界中，像是哺乳动物的眼泪、唾液、鼻涕、组织及鸟类和家禽的蛋清中。依其不同来源，溶菌酶可分为六大类：分别为鸡型(C-type)、鹅型(G-type)、无脊椎动物型(I-type)、噬菌体型(Phage-type)、植物型及细菌型。溶菌酶是一种无毒、且对人和哺乳动物无副作用的蛋白质，因其具有溶菌的特性，近年来也已被广泛地应用于不同工业上。它在乳制品工业中可当作天然防腐剂，例如在巴氏杀菌奶添加溶菌酶能有效地延长其保存期。在食品应用上，可延长水产品及肉食品的储存时间。而在动物饲料工业上能提高动物的生产性能。研究结果显示，在仔猪饲料中额外添加溶菌酶可以提高动物对饲料的转换率及降低腹泻率，改善仔猪健康并减少抗生素的使用。近年来由于全球抗生素药物的滥用，越来越多的细菌发展成抗药性的菌株，许多国家已开始禁止在畜禽饲料中添加抗生素，因此科学家们正努力寻找能够替代传统抗生素的方案，而使得溶菌酶的研究受到越来越广泛的重视。目前许多研究不论是从大自然中筛选新基因或是改造现有的酶，都企图想要得到能满足各种工业应用的溶菌酶。在许多改造酶的策略中，根据酶蛋白结构分析，进而逻辑性地设计突变点是改造酶的主要方法之一。而在此策略中提升酶蛋白的活性也是改良工业酶的一大重点，酶活性愈高就代表成本的下降以及利润的提高，也较有利于工业应用。本专利技术即欲藉由逻辑性地设计突变来提升溶菌酶的活性，进而增加其在工业上的应用价值。
技术实现思路
本专利技术的目的在于改造现有溶菌酶，利用结构分析及点突变技术，以有效提升溶菌酶的活性，进而增加溶菌酶的工业应用价值。为达上述目的，本专利技术的一较广义实施方式为提供一种溶菌酶，其氨基酸序列为将序列编号2第166个位置或与序列编号2具有80％以上序列相似度的序列中对应位置的组氨酸突变成赖氨酸的序列。在一实施例中，编码该序列编号2的基因为从美洲鸵鸟(Rheaamericana)的蛋清中所分离出来的Rham基因。在一实施例中，该溶菌酶为一鹅型溶菌酶。在一实施例中，该溶菌酶的氨基酸序列如序列编号5所示。本专利技术的另一较广义实施方式为提供一种编码前述溶菌酶的核酸分子。本专利技术的又一较广义实施方式为提供一种重组质体，其包含前述核酸分子。附图说明图1显示溶菌酶Rham的蛋白立体结构图。图2显示野生型溶菌酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图3显示点突变技术所采用的引物序列。图4显示H166K突变型溶菌酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。图5显示野生型及H166K突变型溶菌酶的活性分析。具体实施方式体现本专利技术特征与优点的一些典型实施例将在后段的说明中详细叙述。应理解的是本专利技术能够在不同的实施方式上具有各种的变化，其皆不脱离本专利技术的范围，且其中的说明及附图在本质上当作说明之用，而非用以限制本专利技术。本专利技术的溶菌酶基因Rham是从美洲鸵鸟(Rheaamericana，又名三趾鸵鸟)的蛋清(eggwhite)中所分离出来的，其蛋白特性为高耐热性及耐酸性，属于鹅型溶菌酶。近期发现它可以大量地表达在工业上常用的毕赤酵母(Pichiapastoris)中，具有潜在的工业应用价值。为了深入研究以及进一步地改造溶菌酶Rham，本专利技术分析其蛋白结构后针对其活性区域具有关键特性的四十多个氨基酸来做修改。图1显示溶菌酶Rham的蛋白立体结构图。根据蛋白结构重迭比对的结果，Rham蛋白序列第166个位置的组氨酸(H166)位于蛋白立体结构中的活性区内，故被选择作为进行点突变(site-directedmutagenesis)的位置之一，且发现针对H166来进行点突变能提升溶菌酶活性。其它的突变没有增强活性的效果，在此即不再赘述。以下将详述本专利技术改造溶菌酶的方法及其所得到的改良溶菌酶。图2显示野生型溶菌酶的核苷酸序列以及氨基酸序列。如图2所示，野生型溶菌酶Rham基因包含558个碱基(含终止密码子，核苷酸序列以序列编号1标示)，且编码185个氨基酸(氨基酸序列以序列编号2标示)。首先，将Rham基因利用EcoRI以及NotI限制酶切位构筑到pPICZαA载体中，再将该重组质体转形入一感受态细胞(competentcell)中，形成一野生型表达载体。为了提高溶菌酶Rham的活性，本专利技术利用点突变技术以野生溶菌酶基因做为模版进行聚合酶连锁反应(polymerasechainreaction,PCR)步骤，当中所用的突变引物列于图3，其引物序列以序列编号3标示。原始的模板DNA则利用DpnI移除掉。接着把突变质体送入大肠杆菌感受态细胞中以抗生素(Zeocin)作初步筛选，并藉由DNA定序步骤确认成功突变基因。在此，本专利技术构筑了一个突变株H166K，其中H166K意指为溶菌酶Rham第166个位置的氨基酸由组氨酸(histidine)突变成赖氨酸(lysine)。图4即显示H166K突变型溶菌酶的核苷酸序列以及氨基酸序列，其中核苷酸序列以序列编号4标示，氨基酸序列以序列编号5标示。之后在毕赤酵母中表现溶菌酶重组基因。先将溶菌酶的野生型及突变型的重组基因利用PmeI把DNA质体进行线性化之后，藉由电转步骤将DNA送入毕赤酵母内。接着将菌液涂于含有100μg/mlZeocin抗生素的YPD培养基于30℃下进行培养两天。再挑选菌落并接种到5mlYPD于30℃下培养，再次接种到50mlBMGY中于30℃下培养至隔天。接着，将培养基换成含有0.5％甲醇的20mlBMMY来诱导蛋白表达，同样培养于30℃下。每隔24小时取样并补充0.5％甲醇。在经过4天的蛋白质诱导表现之后，将菌液以3500rpm离心并收集上清液，进而检测溶菌酶活性。溶菌酶的活性测试方式是参考先前文献方法再经过修改而成。在本专利技术中是以溶壁微球菌(Micrococcuslysodeikticus)为底物，并利用浊度法来测定溶菌酶活性。首先将溶壁微球菌粉末以pH6.2的磷酸二氢钾缓冲液(66mM)配制成一定浓度(A450＝0.6～0.7)，接着取2.5ml配制好的溶壁微球菌底物加入0.1ml适当稀释的溶菌酶蛋白，迅速混合后检测1分钟内OD450吸光值的变化(25℃)。而1unit的定义为25℃、波长450nm下吸亮度降低0.001为1个酶活力单位。图5显示野生型及H166K突变型溶菌酶的活性分析。如图5所示，H166K突变型溶菌酶的相对比活性为野生型溶菌酶的191％，其活性明显地高于野生型溶菌酶。此外，本专利技术也将野生型及H166K突变型基因进行了50L模拟工业生产的发酵试验，而在50L发酵的结果中，H166K突变型蛋白的活性也是明显地高于野生型。此外，酶在不同物种间通常存在一些变异，但仍具有相同功能，且彼此间大多具有80％以上的氨基酸序列相似度，显见要保本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种溶菌酶，其氨基酸序列为将序列编号2第166个位置或与序列编号2具有80％以上序列相似度的序列中对应位置的组氨酸突变成赖氨酸的序列。

【技术特征摘要】
1.一种溶菌酶，其氨基酸序列为将序列编号2第166个位置或与序列编号2具有80％以上序列相似度的序列中对应位置的组氨酸突变成赖氨酸的序列。2.如权利要求1所述的溶菌酶，其中编码该序列编号2的基因为从美洲鸵鸟(Rheaamericana)的蛋清中所分离...

【专利技术属性】
技术研发人员：陈纯琪，王韬，黄建文，郭瑞庭，
申请(专利权)人：成都必高生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51