一种动物流感抗体阻断检测试纸制造技术

本发明专利技术公开了一种动物流感抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫上吸附流感病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗流感病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“|”和质控线C“|”印迹，检测线T为抗流感病毒单克隆抗体mAb2或抗流感病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG兔抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。本发明专利技术试纸实现了流感病毒中和抗体的快速检测，可实现对动物流感母源抗体和免疫抗体水平的实时监测，以及疫苗免疫效果的免疫评价，并且操作简单，人人都可操作，能较好满足不同层次人员的需要，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。

An Animal Influenza Antibody Blocking Test Paper

【技术实现步骤摘要】
一种动物流感抗体阻断检测试纸
本专利技术涉及一种家禽疫病抗体检测器具，特别是涉及一种动物流感抗体阻断检测试纸。
技术介绍
流行性感冒病毒(Influenzavirus)，简称流感病毒，是一种引起人类及动物患流行性感冒的人兽共患传染病病原，可引起急性上呼吸道感染，并借由空气迅速的传播，在世界各地常发生周期性的大流行。流感病毒为单股负链RNA病毒，属于正黏病毒科(Orthomyxoviridae)流感病毒属，病毒基因组由8条分节段的RNA片段组成，分别编码聚合酶(PB2、PB1、PA)、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、核蛋白(NP)、基质蛋白(M1、M2)、和非结构蛋白(NS1、NS2)等10种病毒蛋白，根据其核蛋白(NP)和基质蛋白(M)的差异性可将流感病毒分为A、B、C三个型，其中A型流感病毒的宿主范围最广，可以感染人类与很多种类的哺乳动物和禽类。根据流感病毒感染宿主的不同可分为不同的群，如人流感病毒、禽流感病毒(AIV)、猪流感病毒(SIV)等；根据其血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)抗原性的不同可将HA分为16个亚型(H1-H16)，NA分为9个亚型(N1-N9)，最近在蝙蝠中发现2种流感病毒新亚型，命名为H17N10和H18N11。流感病毒可由HA和NA的不同组合而形成多种亚型，其中高致病性流感病毒主要分布于H5和H7亚型，世界动物卫生组织(OIE)将高致病性禽流感列为A类动物疫病，我国也将其列为一类动物疫病。高致病性禽流感病毒不仅可对养殖业造成毁灭性打击，而且能够持续不断地跨种间传播感染人类，20世纪以来的流感大流行或地区性流行给全球的公共卫生、经济等带来了重大影响，其流行毒株均为禽或猪流感病毒通过重排或直接转变而形成。目前，我国动物流感的防控采取以疫苗免疫为主的策略，动物母源抗体是影响流感疫苗免疫效果的重要因素，对动物母源抗体和免疫抗体水平的监测是制定和优化流感免疫程序的重要依据；同时，免疫动物的血清抗体水平，尤其是中和抗体水平是流感疫苗免疫评价的重要指标。目前常用流感抗体检测方法包括血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)和病毒中和试验(VN)。HI试验是流感抗体检测的经典方法，可有效评估疫苗免疫抗体水平和免疫保护效果，但血清中的非特异凝集素和非特异抑制素、以及红细胞和主观判定等均影响HI试验的准确性。间接ELISA具有较高的灵敏性，适于大量的血清学监测，可以标准化而且结果易于分析，但不能区分中和与非中和抗体，无法准确评价免疫保护效果。VN试验是最敏感而特异的中和抗体检测方法，流感中和抗体水平与免疫保护直接相关，但该技术方法不但费时，操作繁琐，费用昂贵，而且病毒培养必须在III级生物安全实验室(P3)操作，技术和安全措施要求极高，无法实现临床样品的大量、实时检测。因此，虽然上述检测方法可检测流感抗体水平，但均存在试验操作复杂，耗时长，需要特定的专业技能和仪器设备等，成本昂贵，常限于实验室内进行，很难在基层普及和推广，不适合大批量样本的普查。此外，当前广泛流行的流感病毒流行毒株与我国普遍使用的疫苗毒株在遗传学、免疫反应和保护效力等方面存在较大差异，免疫动物中流感强毒感染仍然时有发生，同时由于缺乏血清学标志和配套的鉴别诊断方法，其在我国的大规模应用使得通过血凝抑制试验(HI)和酶联免疫吸附试验(ELISA)等抗体检测技术很难区分弱毒免疫和野毒感染，不利于流感的控制和净化。免疫层析试纸是在单克隆抗体技术、胶体金免疫层析技术和新材料技术基础上发展起来的一种新型体外检测技术，是理想的即时检测(point-of-caretest,POCT)和现场检测技术，具有更加灵敏、特异、简便、快速等优点，尤其是可实现“傻瓜式”操作，即不需要任何附加仪器设备即可进行现场检测，并在1～5min内判定结果，广泛应用于各种分析物的定性和半定量快速检测，包括抗原、半抗原、抗体和核酸，已成为当今快速敏感的免疫学检测技术之一。因此研制动物疫病病原和抗体检测胶体试纸产品具有重要意义。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的是研制适用于动物流感抗体检测与疫苗免疫评价的动物流感抗体阻断检测试纸，本试纸特异、敏感、快捷、简便，易在生产实践中推广应用。为了实现上述目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种动物流感抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，抗原垫上吸附流感病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗流感病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“|”和质控线C“|”印迹，检测线T为抗流感病毒单克隆抗体mAb2或抗流感病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG兔抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。所述试纸以单克隆抗体阻断模式检测动物流感中和抗体，若在检测膜显现两条红色条带“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，则为动物流感抗体阴性；若显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，则为动物流感抗体弱阳性；若只显现一条红色条带“|”，则为动物流感抗体强阳性。抗流感病毒单克隆抗体mAb1具有血凝抑制HI和病毒中和VN活性，特异识别HA蛋白中和抗原表位；单克隆抗体mAb2具有血凝抑制HI活性，特异识别HA蛋白非中和抗原表位；抗原垫吸附流感病毒检测抗原，流感病毒检测抗原为流感病毒抗原、重组抗原或多肽抗原。抗流感病毒单克隆抗体mAb1和mAb2的制备方法为：(1)流感病毒免疫抗原的制备以不同亚型流感病毒经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，36～48h收取尿囊液，差速离心纯化病毒抗原，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，4℃60000r/min超速离心1h，用7mL0.01mol/LPBS(pH值7.2)重悬沉淀，以血凝试验测定流感病毒的HA效价达2-12以上；(2)抗流感病毒单克隆抗体的制备(2.1)杂交瘤细胞株的建立将流感病毒灭活病毒或疫苗为免疫抗原，免疫小鼠，建立抗不同亚型流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株；(2.2)单克隆抗体的制备(2.3)单克隆抗体的鉴定(2.3.1)病毒反应谱以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定单克隆抗体阳性克隆与不同亚型流感病毒的反应性，筛选获得识别广谱流感病毒单克隆抗体；(2.3.2)识别病毒蛋白以Westernblot检测单克隆抗体识别流感病毒病毒蛋白；(2.3.3)血凝抑制HI活性以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定单克隆抗体腹水的单抗效价，以血凝抑制试验HI测定单克隆抗体腹水的HI活性，筛选获得具有血凝抑制活性单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb2，用于检测线T印迹；(2.3.4)病毒中和VN活性以病毒中和试验测定单克隆抗体腹水对不同亚型流感毒株的中和活性，筛选获得具有病毒中和活性单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb1，用于胶体金标记；(2.3.5)单克隆抗体亚型鉴定利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定流感病毒单克隆抗体的免疫球蛋白亚型；(2.3.6)抗原表位分析利用重叠合成多肽对单克隆抗体识别的抗原表位进行分析；(2.4)单克隆抗体的纯化以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。流感病毒抗原为经甲醛或β-丙内酯BPL灭活的流感病毒尿囊液。流感病毒抗原的具体制备方法为：以不同亚型流感病毒经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，36～120h收取鸡本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种动物流感抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，其特征在于，抗原垫上吸附流感病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗流感病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“|”和质控线C“|”印迹，检测线T为抗流感病毒单克隆抗体mAb2或抗流感病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG兔抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。

【技术特征摘要】
1.一种动物流感抗体阻断检测试纸，由支撑板、抗原垫、金标垫、检测膜和吸水垫构成，其特征在于，抗原垫上吸附流感病毒检测抗原，金标垫吸附胶体金标记的抗流感病毒单克隆抗体mAb1，检测膜上含有检测线T“|”和质控线C“|”印迹，检测线T为抗流感病毒单克隆抗体mAb2或抗流感病毒多克隆抗体pAb1印迹，质控线C为抗小鼠IgG兔抗体pAb2或金黄色葡萄球菌SPA印迹。2.根据权利要求1所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述试纸以单克隆抗体阻断模式检测动物流感中和抗体，若在检测膜显现两条红色条带“||”，且检测线T显色强度与空白对照相当，则为动物流感抗体阴性；若显现两条红色条带“||”，但检测线T明显弱于空白对照，则为动物流感抗体弱阳性；若只显现一条红色条带“|”，则为动物流感抗体强阳性。3.根据权利要求1所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，抗流感病毒单克隆抗体mAb1具有血凝抑制HI和病毒中和VN活性，特异识别HA蛋白中和抗原表位；单克隆抗体mAb2具有血凝抑制HI活性，特异识别HA蛋白非中和抗原表位；抗原垫吸附流感病毒检测抗原，流感病毒检测抗原为流感病毒抗原、重组抗原或多肽抗原。4.根据权利要求3所述的动物流感抗体阻断检测试纸，其特征在于，所述抗流感病毒单克隆抗体mAb1和mAb2的制备方法为：(1)流感病毒免疫抗原的制备以不同亚型流感病毒经尿囊腔接种9～11日龄SPF鸡胚，36～48h收取尿囊液，差速离心纯化病毒抗原，4℃3000r/min低速离心30min去除杂质，4℃60000r/min超速离心1h，用7mL0.01mol/LPBS(pH值7.2)重悬沉淀，以血凝试验测定流感病毒的HA效价达2-12以上；(2)抗流感病毒单克隆抗体的制备(2.1)杂交瘤细胞株的建立将流感病毒灭活病毒或疫苗为免疫抗原，免疫小鼠，建立抗不同亚型流感病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株；(2.2)单克隆抗体的制备(2.3)单克隆抗体的鉴定(2.3.1)病毒反应谱以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定单克隆抗体阳性克隆与不同亚型流感病毒的反应性，筛选获得识别广谱流感病毒单克隆抗体；(2.3.2)识别病毒蛋白以Westernblot检测单克隆抗体识别流感病毒病毒蛋白；(2.3.3)血凝抑制HI活性以免疫过氧化物酶单层细胞试验测定单克隆抗体腹水的单抗效价，以血凝抑制试验HI测定单克隆抗体腹水的HI活性，筛选获得具有血凝抑制活性单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb2，用于检测线T印迹；(2.3.4)病毒中和VN活性以病毒中和试验测定单克隆抗体腹水对不同亚型流感毒株的中和活性，筛选获得具有病毒中和活性单克隆抗体，作为单克隆抗体mAb1，用于胶体金标记；(2.3.5)单克隆抗体亚型鉴定利用单克隆抗体亚型鉴定试剂盒测定流感病毒单克隆抗体的免疫球蛋白亚型；(2.3.6)抗原表位分析利用重叠合成多肽对单克隆抗体识别的抗原表位进行分析；(2.4)单克隆抗体的纯化以辛酸-硫酸铵法从小鼠腹水中纯化单抗IgG。5.根据权利要求3所述的动物...

【专利技术属性】
技术研发人员：李青梅，张改平，王彦红，郭军庆，刘肖，石建州，李鸽，孙亚宁，杨继飞，柴书军，赵东，
申请(专利权)人：河南省农业科学院，
类型：发明
国别省市：河南,41