优化DNA序列、重组质粒、菌株、重组蛋白、鸡毒支原体抗体胶体金检测试纸和检测卡制造技术

本发明专利技术提供一种基于鸡毒支原体VlhA1.2蛋白的优化DNA序列、重组质粒、菌株、重组蛋白、包含所述重组蛋白的鸡毒支原体抗体胶体金检测试纸和检测卡，所述试纸可以用于快速检测禽类对于鸡毒支原体感染后诊断以及免疫后的抗体水平检测。所述优化DNA序列如SEQ ID NO.1所示。将所述优化DNA序列与pGEX‑KG载体连接，得到所述重组质粒pGEX‑KG‑VlhA1.2，转化、表达得到MG‑VlhA1.2重组蛋白。所述试纸包含顺序连接的金标垫和硝酸纤维素膜，其中，所述金标垫上包被有单克隆抗体鼠抗IgY Fc CH3‑CH4的胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上靠近金标垫的一端是包被有MG‑VlhA1.2重组蛋白的检测线。

Optimizing DNA sequence, recombinant plasmid, strain, recombinant protein, colloidal gold test paper and test card for Mycoplasma gallisepticum antibody

【技术实现步骤摘要】
优化DNA序列、重组质粒、菌株、重组蛋白、鸡毒支原体抗体胶体金检测试纸和检测卡
本专利技术涉及动物免疫应用
，特别涉及一种优化DNA序列、重组质粒、菌株、重组蛋白、鸡毒支原体抗体胶体金检测试纸和检测卡。
技术介绍
鸡毒支原体病是由鸡毒支原体(MG)感染引起的传染病，也称慢性呼吸道病(ChronicRespiratoryDisease,CRD)，流行于世界上所有养禽的国家，在我国的感染率也很高，部分地区达75％以上。MG的宿主范围大：鸡、鹌鹑、野鸡、鸭、鸽、鹅、孔雀和鹤等10多种禽类均可感染MG。本病可以通过垂直和水平方式传播，这也是造成鸡毒支原体感染率高、分布广、难以根除的重要原因。无论在发达国家还是在发展中国家，鸡毒支原体病是给养禽业造成巨大经济损失的一种疾病。由于通风不良、过于拥挤、卫生条件差，往往易激发鸡毒支原体病暴发，病情也趋严重。因此，发病后的快速诊断或免疫后对抗体进行动态定量检测己经成为各地养禽场和诊断室的常规检测项目。目前对鸡毒支原体病的诊断方法主要包括病原的分离鉴定、分子生物学方法、血清学诊断方法。对于病原的分离鉴定诊断方法而言，MG的分离培养是对本病进行确诊最基础的环节，但从野外材料中分离MG可能会受到许多外界因素的影响，可能对MG分离率产生较大的影响；另外在实验室对MG进行培养的环节中，由于该病原对营养要求非常苛刻，因此在实际操作过程中存在程序繁琐、各工作环节要求过高、工作量大、耗时长等明显缺点。分子生物学方法包括对MG基因的DNA酶切分析(restrictionendonucleaseanalysis,REA)、物理图谱的构建和DNA指纹分析，DNA探针和PCR。分子生物学诊断法具有特异性强、灵敏度高等特点，但是对实验设备、实验人员具有较高的要求。血清学诊断方法包括血清平板凝集试验(SPA)、血凝抑制试验(HI)、酶联免疫吸附试验(ELISA)，这些方法均在不同程度上存在特异性不强、成本高、专业性强、操作繁琐等缺点，不便于适时和快速诊断，所以均无法在基层大范围地推广使用。胶体金免疫层析(gold-immunochromatographyassayGICA)是以胶体金作为示踪物，基于胶体金标记技术应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术。其核心技术是以硝酸纤维素膜为固相载体，因毛细管作用而促使样品溶液在层析条上泳动，并使样品中的待检物与层析膜上针对待检物的受体(如抗原或抗体)在短时间内发生高特异性、高亲和性的免疫反应。它具有简便、快速、特异性强、灵敏度高、费用低的优点。基于该技术，国内外在人医疾病监测、环境危害监控、食品安全保障及畜禽疾病检测等领域，都已经研制出了多种胶体金免疫层析快速检测检测卡。在鸡疫病诊断和检测方面，鸡传染性支气管炎、鸡传染性法氏囊及鸡毒霉形体抗体免疫胶体金快速检测试纸获得相关专利(专利号：200710169105.X；200710169104.5；200710169106.4)。但是上述试纸是仅对鸡的相关疾病或疫苗免疫后抗体水平进行定性或者半定量检测，仅仅检测一种禽类而不能同时针对多种禽类，并且不能动态定量的监测禽类群体抗体水平。检测多种禽类的免疫水平和评价免疫状况对于疾病的控制有着重要的意义。在实现本专利技术的过程中，专利技术人发现现有技术中至少存在以下问题：尚未公开针对鸡毒支原体抗体的胶体金试纸，可以用于快速、简单检测禽类对于鸡毒支原体的免疫水平。
技术实现思路
鉴于此，本专利技术提供一种基于鸡毒支原体VlhA1.2蛋白的优化DNA序列、重组质粒、菌株、重组蛋白、包含所述重组蛋白的鸡毒支原体抗体胶体金检测试纸和检测卡，所述重组蛋白表达量高，适于生产，且所述试纸可以用于快速检测禽类对于鸡毒支原体的免疫水平。具体而言，根据本专利技术的第一方面，本专利技术实施例提供了一种基于鸡毒支原体VlhA1.2蛋白的优化DNA序列，所述优化DNA序列如SEQIDNO.1所示。根据本专利技术的第二方面，本专利技术实施例提供了一种重组质粒，将如SEQIDNO.1所示的所述优化DNA序列与pGEX-KG载体连接，得到所述重组质粒pGEX-KG-VlhA1.2。具体的，将如SEQIDNO.1所示的所述优化DNA序列的基因5’端加上EcoRI酶切位点，3’端加上XhoI酶切位点，与pGEX-KG载体进行连接反应，得到所述重组质粒pGEX-KG-VlhA1.2。根据本专利技术的第三方面，本专利技术实施例提供了包含所述重组质粒的菌株，所述重组质粒的菌株已于2018年11月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCCNO:M2018792，保藏单位地址是中国武汉武汉大学，分类命名是EscherichiacoliBL21(DE3)MG-VIhA1.2-DE3（大肠杆菌BL21(DE3)MG-VIhA1.2-DE3）。根据本专利技术的第四方面，本专利技术实施例提供了由所述菌株诱导表达得到的MG-VlhA1.2重组蛋白。根据本专利技术的第五方面，本专利技术实施例提供了包含所述MG-VlhA1.2重组蛋白的鸡毒支原体抗体胶体金检测试纸，所述试纸包含顺序连接的样品垫、金标垫和硝酸纤维素膜，其中，所述金标垫上包被有单克隆抗体鼠抗IgYFcCH3-CH4的胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上设有靠近金标垫一端的检测线和远离金标垫一端的质控线，所述检测线上包被有MG-VlhA1.2重组蛋白，所述质控线上包被有二抗，所述单克隆抗体鼠抗IgYFcCH3-CH4由杂交瘤细胞株LZLPHZ分泌得到，据中国公开专利文献CN107299086A记载，所述杂交瘤细胞株LZLPHZ已于2015年11月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC-C2015188。具体的，所述二抗为羊抗鼠IgG抗体。具体的，所述单克隆抗体鼠抗IgYFcCH3-CH4的胶体金标记物的制备方法如下：(1)生成胶体金；(2)于磁力搅拌下，用0.1M碳酸钾溶液调胶体金的pH值至8.0，按8.0μg抗体/mL胶体金加入上述单克隆抗体鼠抗IgYFcCH3-CH4，继续搅拌混匀，加入10％牛血清白蛋白至终浓度为1％，静置30min后12000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用0.02MpH9.0的硼酸盐缓冲液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的0.02MpH9.0的硼酸盐缓冲液，将沉淀重悬，得到单克隆抗体鼠抗IgYFcCH3-CH4的胶体金标记物。进一步具体的，步骤(1)中氯金酸和柠檬酸三钠通过水热法反应生成所述胶体金。根据本专利技术的第六方面，本专利技术实施例提供了包含上述试纸的检测卡。根据本领域常用技术，将所述试纸装入检测卡壳中即可构成所述检测卡。一般的，上述试纸和检测卡的制备方法如下：1)通过对鸡毒支原体VlhA1.2基因进行密码子优化，并连接相应载体从而构建重组质粒pGEX-KG-VlhA1.2，转化、表达后获得MG-VlhA1.2重组蛋白；2)用实验室保存的杂交瘤细胞株LZLPHZ注入经处理过的Balb/C小鼠，得到含单抗的腹水，经辛酸-硫酸铵法(朱立平主编《免疫学常用实验方法》，人民军医出版社，2000版)得到纯化的单克隆抗体鼠抗IgYFcCH3-CH4；3)用柠檬酸三钠与氯金酸(购自Sigma公司)反应制备胶体金；4)将步骤2)制备的鼠抗IgYFcCH3本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于鸡毒支原体VlhA1.2蛋白的优化DNA序列，其特征在于，所述优化DNA序列如SEQ ID NO.1所示。

【技术特征摘要】
1.一种基于鸡毒支原体VlhA1.2蛋白的优化DNA序列，其特征在于，所述优化DNA序列如SEQIDNO.1所示。2.一种重组质粒，其特征在于，将如SEQIDNO.1所示的所述优化DNA序列与pGEX-KG载体连接，得到所述重组质粒pGEX-KG-VlhA1.2。3.如权利要求2所述的重组质粒，其特征在于，通过以下方法得到：将如SEQIDNO.1所示的所述优化DNA序列的基因5’端加上EcoRI酶切位点，3’端加上XhoI酶切位点，与pGEX-KG载体进行连接反应，得到所述重组质粒pGEX-KG-VlhA1.2。4.包含权利要求2或3所述重组质粒的菌株，其特征在于，所述重组质粒的菌株已于2018年11月13日保藏在中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC-M2018792。5.由权利要求4所述菌株诱导表达得到的MG-VlhA1.2重组蛋白。6.包含权利要求5所述MG-VlhA1.2重组蛋白的鸡毒支原体抗体胶体金检测试纸，其特征在于，包含顺序连接的样品垫、金标垫和硝酸纤维素膜，其中，所述金标垫上包被有单克隆抗体鼠抗IgYFcCH3-CH4的胶体金标记物；所述硝酸纤维素膜上...

【专利技术属性】
技术研发人员：李自力，邵雨，胡思顺，毕丁仁，周祖涛，刘梅，石德时，许青荣，
申请(专利权)人：华中农业大学，
类型：发明
国别省市：湖北,42