【技术实现步骤摘要】
—种高效快速测定BAC末端序列的方法
本专利技术涉及生物
,特别涉及一种高效快速测定BAC末端序列的方法。
技术介绍
基因组BAC (Bacterial Artificial Chromosome,细菌人工染色体)文库是含有某种生物体基因组随机片段的重组DNA克隆群体,它在构建物理图谱、基因图位克隆、基因结构分析等研究中具有重要作用。目前许多生物都有高覆盖度的BAC文库。为了方便管理,BAC文库被划分为多个超级池来储存,每个超级池由一定数目的96孔或384孔板组成;在每个超级池中,再将行向、列向和板面的BAC克隆混合,即得到行池、列池和板池。筛选克隆常用3D-PCR筛选系统,第一步是对超级池的DNA进行PCR扩增,找出含有阳性克隆的超级池;接下来对行池、列池和板池的DNA进行PCR扩增,得到克隆所在的行、列、板三个方向信息。由此,两步PCR就可以找到含有目的片段的BAC克隆。 BAC末端序列是指BAC克隆中插入片段的两端序列,能够迅速而精确的定位BAC在基因组上位置。BAC末端测序技术在全基因组测序中有着举足轻重的作用,它能够迅速而精确地进行序列拼装,也可以用来确定基因组序列结构的多态性,如倒置和易位。在许多基于新一代测序的动植物de novo基因组拼接中利用了 BAC末端序列的长程(约100_150kb)的位置关系,辅助基因组的拼接。在白菜基因组的de novo测序中,研究者利用BAC末端序列的信息将Scaffold N50从500kb提高到2Mb,显示了这一应用的潜力。 目前BAC末端测序都是基于Sanger技术的 ...
【技术保护点】
一种测定BAC末端序列的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:(1)以超级池为单位,富集每个超级池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列,制备成适合新一代测序平台所需的文库;(2)在新一代测序平台上进行测序;(3)通过生物信息学的方法将混合的BAC末端序列回归到单个克隆:利用序列比对,确定每个BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息,定位出每个克隆的BAC末端序列。
【技术特征摘要】
1.一种测定BAC末端序列的方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤: Cl)以超级池为单位,富集每个超级池中的行池、列池和板池中所有BAC末端序列,制备成适合新一代测序平台所需的文库; (2)在新一代测序平台上进行测序; (3)通过生物信息学的方法将混合的BAC末端序列回归到单个克隆:利用序列比对,确定每个BAC末端序列所在的行池、列池和板池信息,定位出每个克隆的BAC末端序列。2.根据权利要求1所述的方法,其特征在于,步骤(1)的方法为:用CovarisS220超声破碎系统将超级池的行池、列池和板池中BAC DNA分别打断成400-500bp,经过末端修复后,在DNA两端连接上特定接头,再通过特异的PCR引物扩增含BAC末端序列的区域,纯化并胶回收300-350bp扩增产物,即制成含所有BAC末端序列的测序文库。3.根据权利要求2所述的方法,其特征在于,步骤(1)中制备上述含所有BAC末端序列的测序文库的方法包括如下步骤: (Al)将BAC DNA打断:在1.5ml离心管中加入5 μ g BACDNA,用TE溶液稀释将其体积补充至130 μ L,把稀释好的DNA注入Covaris microTube,设置Covaris S220参数,将DNA打断成 400-500bp ; (A2)末端修复:配制末端修复反应的体系,混匀,室温放置20min,反应结束后,用1.8 X AMPure XP Bea ds 纯化,50 μ L TE 溶液洗脱; (A3)连接接头:配制连接接头反应的体系,混匀,室温放置30min ;反应结束后,用1.8 X AMPure XP Beads 纯化,30 μ L TE 溶液洗脱; (Α4)特异性PCR富集BAC末端序列:配制PCR反应的体系,设置好程序进行PCR扩增反应;反应结束后,用1.5 X AMPure XPBeads纯化,30u...
【专利技术属性】
技术研发人员:胡晓湘,谈成,李宁,
申请(专利权)人:中国农业大学,
类型:发明
国别省市:北京;11
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