一种改善间质干细胞生物学功能的方法技术

本发明专利技术公开了一种改善间质干细胞生物学功能的方法，所述方法是通过线粒体分裂抑制剂靶向间质干细胞的线粒体来改善间质干细胞生物学功能的。采用该方法不仅促进MSC长期扩增，而且使MSC衰老明显延缓，促进其分泌多种细胞因子。并且通过动物模型验证发现，处理后的MSC在体内移植存活时间增加，可有效提高MSC治疗急性脑卒中及多种炎症性疾病的效果。有助于解决细胞治疗的临床转化中MSC数量、功能不足等问题，具有良好的应用前景。

A Method for Improving the Biological Function of Mesenchymal Stem Cells

【技术实现步骤摘要】
一种改善间质干细胞生物学功能的方法
本专利技术涉及一种改善间质干细胞生物学功能的方法。
技术介绍
干细胞是生物体中具有自我更新和分化潜能的种子细胞，在胚胎发育与疾病损伤条件下可发挥组织再生与修复功能，被视为具有再生多组织多器官的潜能。干细胞的分离与体外培养，有望为其临床转化奠定基础，最终实现对人类一系列疾病谱的精准治疗，提高人类的生活质量，延长人类寿命。其中，间质干细胞治疗作为细胞治疗重要的组成部分，最初是从骨髓中分离得到的一种非造血类的干细胞，它参与构成骨髓造血微环境，对造血干细胞的增殖与分化具有明显的支持作用(Friedenstein,A.J.,etal.,1974)。随后发现间质干细胞可粘附于塑料培养板上生长，具有类似于成纤维细胞的形态，能自我更新，体外可分化为成骨细胞、脂肪细胞、软骨细胞，表达CD29、CD44、CD73、CD54、CD90、CD105和CD166，但不表达造血干细胞标志物CD11b、CD14、CD19、CD34、CD45等(Kfoury,Y.，etal.,2015)。传统上一直认为，干细胞是通过分化为特定细胞来替代病损的组织器官，间质干细胞具有直接分化为成骨细胞、软骨细胞的能力，可以通过直接替代损伤细胞从而在大段骨缺损或软骨损伤的修复中发挥作用。近年来的研究发现，MSC具有营养支持与免疫调节功能可能在组织损伤修复与疾病治疗中扮演了更加重要的角色。例如，MSC通过旁分泌营养介质(trophicmediators)可以抑制缺血导致的凋亡、抑制瘢痕形成、刺激血管新生和维持血管稳定性、刺激组织内源性干细胞分裂(Caplan,A.I.,etal.,2011)；在MSC的免疫调节方面(Wang,Y.,etal.，2014)，MSC能抑制T细胞由丝裂原刺激的增殖反应，增加调节性T细胞比例，降低Th1/Th2比例，进而引起Th17数量下降；MSC可以抑制B细胞的增殖、活化以及其抗体分泌，影响B细胞的趋化功能；MSC抑制NK细胞增殖、细胞毒作用和细胞因子的分泌；MSC还影响APC细胞的抗原递呈功能，通过下调抗原提呈细胞表面的MHC分子以及共刺激分子(CD40、CD86、CD80)和抑制DC细胞成熟来抑制T细胞的活化。同时，参与MSC免疫调节作用的主要分子包TGFβ、前列腺素E2(PGE-2)、一氧化氮(NO)、吲哚胺-2,3-双加氧酶(IDO)等。间质干细胞广泛分布于全身各个组织和器官，除骨髓外，还存在于牙龈，骨骼肌、脂肪等组织中，参与组织的损伤修复及稳态维持。由于其易分离，可向成骨、成脂、成软骨等多个方向分化，具有免疫调节和旁分泌功能，决定了其在损伤修复和组织再生中的广阔应用前景。到目前为止，在www.clinicaltrials.gov注册的与间质干细胞相关的临床实验超过600项，适应症包括移植物抗宿主病(graft-versus-hostdisease，GVHD)、心肌梗死(MyocardialInfarction，MI)、肝硬化(HepaticCirrhosis)、多发性硬化(MultipleSclerosis，MS)、系统性红斑狼疮(SystemicLupusErythematosus，SLE)、器官移植(OrganTransplantation)等方面(Mendicino,M.,etal.，2014；Trounson,A.,etal.，2015)。本课题组前期已掌握通过流式细胞仪分选7日龄Nestin-GFP转基因小鼠的MSC的方法，并且鉴定出表面标志物CD29、CD44、CD73、CD90、CD105和CD166可用于分选MSC，建立了一套完整的MSC分选体系，推进了MSC的临床转化进程。要实现其临床转化，首先要具备充足细胞。但是7日龄小鼠的骨髓体积小，细胞总量远少于成体小鼠，成体小鼠提取的骨髓间质干细胞是种子细胞的常见来源。而基于目前的MSC培养技术，成体组织中分离的MSC在体外扩增十代后增殖能力下降，限制了其应用前景，因此需要探究一种能够促进成体MSC长期扩增培养的方法。细胞扩增是一个能量代谢极其旺盛的过程，需要充足的能量以供合成大量DNA和蛋白质，而线粒体作为细胞能量代谢的核心场所，在调控细胞增殖中起着重要作用。线粒体在不同的功能状态下表现出不同的线粒体形态(Chen,H.,etal.,2017)。(如表1所示)表1线粒体形态鉴于线粒体形态结构在干细胞增殖中的重要作用，调控线粒体动力蛋白的表达和活性，被认为具有促进细胞扩增和细胞保护的作用。线粒体的动力蛋白包括线粒体分裂蛋白和融合蛋白两大家族，线粒体分裂蛋白中以Drp1为主要介导线粒体分裂的蛋白，抑制Drp1的活性可延长线粒体，使线粒体形态呈现为管状。Mdivi-1是一种新发现的线粒体分裂抑制剂，可通过抑制线粒体分裂蛋白Drp1的装配而抑制线粒体分裂。在循环系统的研究中，Mdivi-1可改善脑卒中的预后，保护细胞抵抗缺血再灌注损伤，提示其对细胞具有保护作用(Li，L.,etal.，2017；Dedkova,B.,etal.，2012；Prasad,N.,etal.,2012)。因此，向培养基中增添Mdivi-1有望保护MSC，实现成体MSC的长期培养、扩增。目前尚未见有关研究报道实现靶向线粒体的改变和MSC的长期培养扩增。
技术实现思路
基于上述问题，本专利技术的目的在于克服上述现有技术的不足之处而提供一种一种间质干细胞扩增培养基，本专利技术提供了一种改善间质干细胞生物学功能的方法，以及通过该方法得到的间质干细胞及其用途。本专利技术所提供的改善间质干细胞生物学功能的方法是通过线粒体分裂抑制剂靶向线粒体来改善间质干细胞生物学功能的，采用该方法可解决成体组织中分离的MSC扩增代数有限，增殖能力较弱以及生物学功能较差的技术难题，并且可以延缓间质干细胞衰老。为实现上述目的，本专利技术采取的技术方案包括以下几个方面：在第一个方面，本专利技术提供了一种间质干细胞扩增培养基，所述间质干细胞扩增培养基含有液体基础培养基和线粒体分裂抑制剂；优选地，所述线粒体分裂抑制剂为Mdivi-1。本专利技术所述的Mdivi-1是一种小分子化合物，中文名为：3-(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)-2-3-二氢-2-硫代氧-4(1H)-喹唑啉酮或3-(2，4-二氯-5-甲氧基苯基)-2-磺酰基-4(3H)-喹唑啉酮；分子式为：C15H10Cl2N2O2S；分子量为：353.22。优选地，所述间质干细胞扩增培养基的制备方法包括以下步骤：(1)将Mdivi-1溶解于DMSO中，得到Mdivi-1的储存溶液；(2)将步骤(1)得到的Mdivi-1的储存溶液添加到液体基础培养基中，得到间质干细胞扩增培养基。优选地，所述线粒体分裂抑制剂在所述间质干细胞扩增培养基中的浓度为1～10μmol/L；优选地，所述线粒体分裂抑制剂在所述间质干细胞扩增培养基中的浓度为5μmol/L。优选地，所述间质干细胞扩增培养基为无血清培养基，所述间质干细胞扩增培养基包括：所述液体基础培养基、所述线粒体分裂抑制剂、10.01μg/L的细胞培养营养添加物、1ng/ml的白血病抑制因子、抗氧化剂、1％的非必需氨基酸和40ng/ml的细胞生长因子；优选地，所述液体基础培养基为DMEM/F12培养基，所述细胞培养营养添加本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种间质干细胞扩增培养基，其特征在于，所述间质干细胞扩增培养基含有液体基础培养基和线粒体分裂抑制剂；优选地，所述线粒体分裂抑制剂为Mdivi‑1。

【技术特征摘要】
1.一种间质干细胞扩增培养基，其特征在于，所述间质干细胞扩增培养基含有液体基础培养基和线粒体分裂抑制剂；优选地，所述线粒体分裂抑制剂为Mdivi-1。2.根据权利要求1所述的间质干细胞扩增培养基，其特征在于，所述线粒体分裂抑制剂在所述间质干细胞扩增培养基中的浓度为1～10μmol/L；优选地，所述线粒体分裂抑制剂在所述间质干细胞扩增培养基中的浓度为5μmol/L。3.根据权利要求1所述的间质干细胞扩增培养基，其特征在于，所述间质干细胞扩增培养基为无血清培养基，所述间质干细胞扩增培养基包括：所述液体基础培养基、所述线粒体分裂抑制剂、10.01μg/L的细胞培养营养添加物、1ng/ml的白血病抑制因子、抗氧化剂、1％的非必需氨基酸和40ng/ml的细胞生长因子；优选地，所述液体基础培养基为DMEM/F12培养基，所述细胞培养营养添加物包括亚硒酸钠、胰岛素、转铁蛋白和乙醇胺，所述亚硒酸钠、胰岛素、转铁蛋白和乙醇胺的重量比为1:1000:1000:1，所述白血病抑制因子为LIF，所述抗氧化剂包括还原型谷胱甘肽、β-巯基乙醇中的至少一种，所述细胞生长因子包括bFGF、EGF，所述bFGF、EGF的重量比为1:1；更优选地，所述还原型谷胱甘肽在间质干细胞扩增培养基中的浓度为1.5mg/L，所述β-巯基乙醇在间质干细胞扩增培养基中的浓度为0.1mmol/L。...

【专利技术属性】
技术研发人员：张秀明，
申请(专利权)人：张秀明，
类型：发明
国别省市：广东,44