一种基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒及其检测方法技术

一种基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于免疫检测技术领域。本发明专利技术试剂盒包含：酶标板、辣椒碱标准品、酶标物、显色液、终止液、10×浓缩洗涤液、抗体工作液、样品稀释液和样品复溶液。通过洗涤工作液的制备、标准溶液的配置、标准曲线的绘制、待测样品的准备、测定和计算得到检测结果。本发明专利技术的优点是能准确灵敏地检测食用油中辣椒碱含量，样品前处理过程简单，耗时少，能同时检测大量样品，检测成本远低于传统仪器检测方法。本发明专利技术能实现地沟油的现场高通量快速检测，为日常监管提供重要的技术手段，为我国食用油的质量安全提供有力的技术保障，具有重要的现实意义。

An Enzyme-linked Immunoassay Kit for Ditch Oil Based on Capsaicin Index and Its Detection Method

【技术实现步骤摘要】
一种基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒及其检测方法
本专利技术涉及一种基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，属于免疫检测

技术介绍
“地沟油”问题是多年来我国食用植物油质量安全领域面临的重大难题。广义的地沟油，指各类废弃的劣质食用油（wasteedibleoils），主要的第一大类是餐厨废油脂（restaurantwastelipids），来源于下水道中的油腻漂浮物或者是宾馆、酒楼的剩饭、剩菜（通称泔水）；第二类来源是由劣质动物皮、肉、内脏加工提炼后产出的油；第三类来源是回收油脂，包括餐饮店使用的泛油、煎炸老油等。但流向地沟油加工窝点的主要是餐厨废弃油脂，早在1990年，就有报道称北京朝阳区在八个月之内取消了三个地沟油炼制点。这是在CNKI数据库中能查到的关于地沟油的最早报道。1991年下半年，一伙不法之徒在北京西南郊苗圃，用从各家饭馆收集的泔水炼制“地沟油”，之后再将其卖给个体饭馆。工商人员曾一次查获21桶“地沟油”，达2000多公斤。据报道，世界上每年产生的餐厨废弃油脂大概有1000万吨。从CNKI数据库中对于地沟油的研究报道来看，最初我国学者大多也以变废为宝的思想来研究地沟油，除转化物为柴油外，还可以用于生产肥皂等。然而由于成本较高，利润不够丰厚，这些工作因而依然没有阻止地沟油流向餐桌，危害人们的身体健康。地沟油经历了多次高温反复油炸与下水道的氧化腐化过程，成分发生变化，产生了如黄曲霉素、苯并芘、反式脂肪酸等各种有毒物质，并含有洗涤剂成分，如长期食用必然会引发身体的疾病。轻则引起消化不良、腹泻，严重的会引发贫血、中毒性肝病等症状，长期食用有诱发癌症的危险，危害极大。辣椒碱是辣椒果实中所含的辛辣成分，其主要用途是用于调味品生产，以及火锅底料，凉菜，休闲食品、方便食品、快餐、微波食品等。辣椒除了上面所述的几种深加工方法外，还可以加工成各种即食食品，如腌青辣椒、豆瓣辣酱、五香辣椒、辣椒芝麻酱、辣椒糊等。正常食用油里一般不含辣椒碱成分，但由于辣椒作为调味料，在全国各地的菜系中都有涉及，于是作为地沟油主要来源的泔水油，不可避免会含有辣椒碱。辣椒碱的理化性质非常稳定，能够耐受高温，脂溶性极强，在随食物烹饪过程中，其化学结构不易被破坏，而且在地沟油精炼过程中，辣椒碱依然难以被全部去除，不可避免的会有辣椒碱残留，即使只有痕量辣椒碱存在，只要有高灵敏的辣椒碱检测方法就能识别。地沟油目前的检测方法有基于其理化性质建立的感官鉴定法，也有凯氏定氮法、电导法、光谱法（如紫外—可见光谱法、荧光分析法、红外光谱法以及核磁共振法）、色谱法（如气相色谱法、高效液相色谱法）、离子色谱法等较为常见及普遍的方法。但是感官鉴定法只能用于食源性样品中辣椒素的检测；电导法不适合深度精炼的地沟油，因为深度精炼可除去油脂中大部分的水溶性离子和极性分子，使得地沟油电导率大大降低；凯氏定氮法、可见光谱法及荧光分析法易受样品中杂质的影响；而气相色谱法、高效的液相色谱法、红外光谱法以及核磁共振法虽然具有较高的灵敏性及准确度，但是该方法需要专业操作人员及昂贵的精密仪器，分析成本高，虽然适用于专业检测实验室，但是无法满足现场快速检测的要求。基于现有这些方法的检测灵敏度和特异性，通过监测辣椒素类物质判别“地沟油”的准确率在80%左右。根据目前国内外资料显示，基于抗原抗体检测辣椒碱的免疫分析方法研究很少，还没有商品化产品。而ELISA方法具有高特异性、高灵敏度、低成本、适合现场检测、操作简便、快速，可实现高通量定量检测的优势，如果有了这样一款产品，就能为地沟油的日常监管提供高效的快速检测手段，为我国食用油的质量安全提供有力的技术保障。
技术实现思路
本专利技术的目的是克服上述不足之处，提供一种基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒及其检测方法，本着高效、节约、迅速的原则，利用辣椒碱抗体抗原，研制开发酶联免疫（ELISA）技术，使得地沟油的检测过程简便，准确性和特异性大幅提高。本专利技术的技术方案，一种基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒，该试剂盒包含：酶标板、辣椒碱标准品、酶标物、显色液、终止液、10×浓缩洗涤液、抗体工作液、样品稀释液和样品复溶液。进一步的，所述酶标板为已经用辣椒碱包被抗原制作好的酶标板，包被浓度为0.1µg/mL。进一步的，辣椒碱包被抗原制备过程为：a、以香兰素胺盐酸盐作为半抗原，称取20mg于反应瓶中，加入400μLDMF溶解，称取11.4~11.6mgNHS于反应瓶中，再加入19.0~19.2mgEDC盐酸盐，室温避光搅拌过夜；b、取上清活泼酯液，分别逐滴滴加到224mgBSA溶液中反应，反应缓冲液为0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液；反应在磁力搅拌下室内温度避光进行4h，从加样结束开始计时；c、将反应液置透析袋内，于0.01MpH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每8h更换一次透析液，共更换4次，透析结束后，即得到辣椒素人工偶联抗原，即辣椒碱包被抗原。进一步的，所述辣椒碱标准品的浓度依次为0，0.1ng/mL，0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL；进一步的，所述酶标物为HRP标记的羊抗鼠IgG，工作浓度为0.1μg/mL；进一步的，所述显色液为显色液A液和显色液B液；进一步的，所述终止液为2mol/L硫酸溶液；进一步的，所述10×浓缩洗涤液具体为添加了质量浓度为0.05%Tween-20的0.02mol/LPBS缓冲液，其pH为7.4。进一步的，所述抗体工作液为浓度0.6µg/mL的CGMCCNo.14689的杂交瘤细胞株分泌所得抗体溶液。所述抗体由专利号201811269168.7“一种分泌辣椒碱单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用”所公布的方式制得。进一步的，所述样品稀释液配方为：500mL浓度为96％以上的甲醇中加按质量浓度计1％乙腈、49％的浓度为97％以上的氯仿、0.025％Tween-20。进一步的，样品复溶液配方为：950mL蒸馏水中加入按质量浓度计0.02％KCl、0.023％~0.024％KH2PO4、0.8％NaCl、0.362％~0.363％Na2HPO4、5％甲醇、0.025％Tween-20和0.02％PEG-20000。本专利技术还提供了一种基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒的检测方法，步骤如下：（1）洗涤工作液的制备：取10×浓缩洗涤液，按照1份10×浓缩洗涤液兑9份去离子水的比例配置1×洗涤工作液，用于对酶标板进行清洗；（2）标准溶液的配置：采用辣椒碱标准品配置标准溶液，具体浓度如下：0，0.1ng/mL，0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL；在酶标板上按照上述浓度顺序加入标准溶液，50μL/孔，至少两个重复；（3）标准曲线的绘制：每孔加入50μL0.6μg/mL抗体工作液，37℃温育30min后，取出并将孔内液体甩干，每孔依次加入步骤（1）中已配置好的1×洗涤工作液200μL，倒出液体，此后再重复洗涤2次，最后拍干；每孔加入100μL的酶标物，酶标板装入袋中后再放入保温箱中保温30min，取出后将孔内液体甩干，每孔加入步骤（1）中已配置好的1×洗涤工本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：酶标板、辣椒碱标准品、酶标物、显色液、终止液、10×浓缩洗涤液、抗体工作液、样品稀释液和样品复溶液。

【技术特征摘要】
1.一种基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒包含：酶标板、辣椒碱标准品、酶标物、显色液、终止液、10×浓缩洗涤液、抗体工作液、样品稀释液和样品复溶液。2.根据权利要求1所述基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述酶标板为已经用辣椒碱包被抗原制作好的酶标板，包被浓度为0.1µg/mL；所述辣椒碱包被抗原制备过程为：a、以香兰素胺盐酸盐作为半抗原，称取20mg于反应瓶中，加入400μLDMF溶解，称取11.4~11.6mgNHS于反应瓶中，再加入19.0~19.2mgEDC盐酸盐，室温避光搅拌过夜；b、取上清活泼酯液，分别逐滴滴加到224mgBSA溶液中反应，反应缓冲液为0.05mol/LpH9.6的碳酸盐缓冲液；反应在磁力搅拌下室内温度避光进行4h，从加样结束开始计时；c、将反应液置透析袋内，于0.01MpH7.4的PBS中4℃搅拌透析，每8h更换一次透析液，共更换4次，透析结束后，即得到辣椒素人工偶联抗原，即辣椒碱包被抗原。3.根据权利要求1所述基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述辣椒碱标准品的浓度依次为0，0.1ng/mL，0.25ng/mL、0.5ng/mL、1ng/mL、2ng/mL、5ng/mL、10ng/mL；所述酶标物为HRP标记的羊抗鼠IgG，工作浓度为0.1μg/mL；所述显色液为显色液A液和显色液B液；所述终止液为2mol/L硫酸溶液；所述10×浓缩洗涤液具体为添加了质量浓度为0.05%Tween-20的0.02mol/LPBS缓冲液，其pH为7.4。4.根据权利要求1所述基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述抗体工作液为浓度0.6µg/mL的CGMCCNo.14689的杂交瘤细胞株分泌所得抗体溶液。5.根据权利要求1所述基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述样品稀释液配方为：500mL浓度为96％以上的甲醇中加按质量浓度计1％乙腈、49％的浓度为97％以上的氯仿、0.025％Tween-20。6.根据权利要求1所述基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒，其特征在于：所述样品复溶液配方为：950mL蒸馏水中加入按质量浓度计0.02％KCl、0.023％~0.024％KH2PO4、0.8％NaCl、0.362％~0.363％Na2HPO4、5％甲醇、0.025％Tween-20和0.02％PEG-20000。7.权利要求1所述基于辣椒碱指标的地沟油酶联免疫检测试剂盒的检测方法，其特征是步骤如下：（1）洗涤工作液的制备：取10×浓缩洗涤液，按照1份10×浓缩洗涤液兑9份去离子水的比例配置1×洗涤工作液，用于对酶标板进行清洗；（2）标准溶液的配置：采用辣椒碱标准品配置标准溶液，具体浓度如下：0，0.1...

【专利技术属性】
技术研发人员：胥传来，刘丽强，孙佳佳，仇雪，林文祥，陶睿，
申请(专利权)人：江南大学，
类型：发明
国别省市：江苏,32