一种类器官球体的高通量培养方法技术

本发明专利技术提供了一种类器官球体的高通量培养方法，所述高通量培养方法包括以下步骤：(1)将含细胞的基质胶和氟油分别注射进三通装置中得到类器官球体；(2)将步骤(1)中得到的类器官球体加热后与3D打印平台联动并将类器官球体进行分配，而后进行培养类器官球体；本发明专利技术提供的高通量培养方法，通过微流控生成类器官后结合3D打印平台，能够简便、快速、精确的将类器官打印至培养载体中，类器官的大小和结构合适、均一可控，每个培养载体的培养腔内类器官数量固定，同时实现药物敏感性测试和毒性测试，临床预测更为准确，应用前景良好，具有非常高的应用价值。

A High-throughput Culture Method for Organ-like Spheres

【技术实现步骤摘要】
一种类器官球体的高通量培养方法
本专利技术属于医疗器械领域，涉及一种类器官球体的高通量培养方法。
技术介绍
癌症一直是影响全球人体健康的最主要的因素。近几年癌症相关的靶向新药与肿瘤免疫新疗法的研发越来越多。但以患者作为研究对象的研究具有不可操控性，而实验动物与人差异巨大实验结果迁移难度大，2D细胞系培养缺乏体内微环境失去了肿瘤部分特性因而结果不准确。目前这些问题导致了从基础到临床的转化效率极低，肿瘤类器官的兴起为转化医学提供了全新的技术平台。肿瘤类器官是从单个肿瘤样本中培养的类器官，该模型很好的保留了肿瘤异质性，同时能够进行扩增，冷冻保存及基因改造，因此目前建立了大规模的肿瘤类器官库。肿瘤类器官研究已经成为肿瘤基础和临床研究中的重要工具，对揭示肿瘤发生发展的机制、快速评估肿瘤药物与免疫细胞的治疗效果意义重大。但是目前肿瘤类器官的制作及药物筛选仍提留在小规模的实验室研究阶段，制作方法高度依赖实验员的技术，实验结果不可控性较大，同时将制作好的肿瘤类器官转移至96孔或者384孔中费时费力，操作过程也不可控，易造成类器官大小不一，各孔类器官数目不统一等不可控因素导致实验结果不准确。微流控技术是一项在微米尺度空间对流体进行操控的技术，以其高通量、高灵敏度、低消耗等优点备受研究者关注，是一门涉及化学、流体物理、微电子、新材料、生物学和生物医学工程的新兴交叉学科。微流控技术主要应用流体的层流和液滴现象。微流控能够以非常高的通量制备高度单分散性的液滴乳液。常见的微通道结构为T型和ψ型。在某些情况下，含有不同高分子聚合物的水相液体在微流控通道中也会形成不互溶的液滴。3D生物打印机是一种能够在数字三维模型驱动下，按照增材制造原理定位装配生物材料或细胞单元，制造医疗器械、组织工程支架和组织器官等制品的装备。而目前肿瘤类器官制备的过程不可控，制备得到的器官不均一，随实验人员的操作不同而变化，还需要手动挑选适合大小、结构的器官，并且需要手动将培养成熟的类器官转移至96/384孔板等高通量培养载体中，耗时费力。CN108486035A公开了一种三维类器官的液滴培养方法，该方法将移液枪头与常规细胞培养方法相结合，利用移液枪头形成球形构象的液滴作为培养载体，在其中培养制备毫米级的三维类器官组织。通过对移液枪头剪截位置、注入液体体积、液滴与截面间的接触角角度等因素的筛选分析，获得了比较理想的类器官液滴培养条件。同时，可以通过对上述条件的适时调整，对三维类器官的形态(形状和大小)进行灵活有效的控制。此外，该方法还具有操作简便、培养成本低廉、培养效率高等优点，培养制备的毫米级三维类器官组织可满足在个性化治疗早期进行体外药物筛选的需要。但是这种方法仍然存在需要实验人员操作的问题，可能会造成培养的不均一。目前，还没有方法将微流控技术与3D打印平台共同使用来进行高通量制造和培养类器官。
技术实现思路
针对现有技术的不足，本专利技术的目的在于提供一种类器官的高通量培养方法，以解决现有的细胞系培养结果不准确、类器官制备不均一不可控、类器官分配不方便的问题。为达到此专利技术目的，本专利技术采用以下技术方案：本专利技术提供了一种类器官球体的高通量培养方法，所述高通量培养方法包括以下步骤：(1)将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到类器官球体；(2)将步骤(1)中得到的类器官球体加热后与3D打印平台联动并将类器官球体进行分配，而后进行培养类器官球体。本专利技术提供的高通量培养方法，以类器官为生物墨水，利用液滴现象，通过微流控生成类器官后结合3D打印平台，能够简便、快速、精确的将类器官打印至培养载体中，这个过程不随操作人员的变化而变化，类器官的大小和结构合适、均一可控，每个培养载体的培养腔内类器官数量固定，并且能够自动化打印2种以上的不同类器官，同时实现药物敏感性测试和毒性测试，相比于2D细胞系培养缺乏体内微环境失去了肿瘤部分特性导致预测结果不准确，本专利技术的高通量培养方法结果更为准确。本专利技术提供的高通量培养方法，可以得到类器官球体，而现有的方法得到的类器官一般不均一，可能会产生成团等现象，不能够明确分配均匀，无法得到类器官球体。本专利技术所述类器官可以是肿瘤类器官、肝脏类器官、心脏类器官、肾脏类器官等等。本专利技术所述高通量培养方法的含义为：能一次将类器官球体直接均匀地分散于多块96孔/384孔板中培养，并能进行后续快速药物筛选实验。本专利技术所述联动的含义为：三通装置与3D打印平台连成一个整体，共同实时运行。优选地，步骤(1)所述含细胞的基质胶由细胞与基质胶混合后制备得到。优选地，所述细胞的个数为1.0×105～1.0×107个，例如可以是1.0×105个、1.0×106个、2.0×106个、3.0×106个、4.0×106个、5.0×106个、1.0×107个等，优选为2.0×106个。在本专利技术中，细胞的个数不能过高或者过低，如果细胞个数过低，则细胞几乎不能够生长；如果细胞的个数过高，则会使得形成的球体易爆。优选地，所述细胞为原代细胞。本专利技术所述原代细胞经过提取得到。原代细胞提取方法：通过手术或穿刺得到的癌组织或动物组织，4度条件下剪切成1mm左右的小块，利用I型胶原酶在37度细胞培养箱中消化1小时，利用100μm滤网过滤细胞，利用红细胞裂解液裂解红细胞，离心并用培养基重悬细胞，细胞计数后备用。优选地，所述基质胶的体积为20～200μL，例如可以是20μL、40μL、60μL、80μL、90μL、100μL、110μL、120μL、130μL、140μL、150μL、160μL、170μL、180μL、190μL或200μL等，优选为100μL。优选地，所述混合的温度为2～8℃，例如可以是2℃、3℃、4℃、5℃、6℃、7℃、8℃等，优选为4℃。在本专利技术中，氟油能够更好的产生液滴现象，对于含细胞的基质胶能够产生良好的液液界面张力和剪切力作用，使得含细胞的基质胶流体形成高度均一的间断流，而氟油与含细胞的基质胶会形成乳液，通过这种微流控的方法，自下而上的将类器官剪切包裹成球体，使得最终可形成类器官球体。优选地，步骤(1)所述通入的方法为注射。本专利技术所述通入的方法不仅限于注射，任何可以将两种液体加入到三通中的方法均适用于本专利技术。优选地，所述注射的方法为：将含细胞的基质胶和氟油分别置于两个注射装置中，然后分别通过管道注射进三通装置中。在本专利技术中，注射装置一般通过管道与三通装置的其中两个管道连接，三通装置的另一个管道用来转移形成的类器官球体。优选地，所述含细胞的基质胶的流速为1～100μL/min，例如可以是1μL/min、5μL/min、10μL/min、15μL/min、16μL/min、17μL/min、18μL/min、19μL/min、20μL/min、21μL/min、22μL/min、23μL/min、24μL/min、25μL/min、30μL/min、40μL/min、50μL/min、60μL/min、80μL/min、100μL/min等，优选为20μL/min；优选地，所述氟油的流速为1～500μL/min；例如可以是1μL/min、5μL/min、10μL/min、20μL/min、30μL/min、40μL/min、45μL/min、46μL/min、4本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种类器官球体的高通量培养方法，其特征在于，所述高通量培养方法包括以下步骤：(1)将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到类器官球体；(2)将步骤(1)中得到的类器官球体加热后与3D打印平台联动并将类器官球体进行分配，而后进行培养类器官球体。

【技术特征摘要】
1.一种类器官球体的高通量培养方法，其特征在于，所述高通量培养方法包括以下步骤：(1)将含细胞的基质胶和氟油分别通入到三通装置中得到类器官球体；(2)将步骤(1)中得到的类器官球体加热后与3D打印平台联动并将类器官球体进行分配，而后进行培养类器官球体。2.根据权利要求1所述的高通量培养方法，其特征在于，步骤(1)所述含细胞的基质胶由细胞与基质胶混合后制备得到。3.根据权利要求2所述的高通量培养方法，其特征在于，所述细胞的个数为1.0×105～1.0×107个；优选为2.0×106个；优选地，所述细胞为原代细胞；优选地，所述基质胶的体积为20～200μL；优选为100μL；优选地，所述混合的温度为2～8℃；优选为4℃。4.根据权利要求1-3中任一项所述的高通量培养方法，其特征在于，步骤(1)所述通入的方法为注射。5.根据权利要求4所述的高通量培养方法，其特征在于，所述注射的方法为：将含细胞的基质胶和氟油分别置于两个注射装置中，然后分别通过管道注射进三通装置中。6.根据权利要求5所述的高通量培养方法，其特征在于，所述含细胞的基质胶的流速为1～100μL/min；优选为20μL/min；优选地，所述氟油的流速为1～500μL/min；优选为50μL/min；优选地，所述注射装置的温度为2～8℃；优选为4℃；优选地，所述管道的直径为200～1000μm，优选为800μm。7....

【专利技术属性】
技术研发人员：马少华，蒋盛威，
申请(专利权)人：清华伯克利深圳学院筹备办公室，
类型：发明
国别省市：广东,44