一种在人血浆中筛选的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及其制备方法和应用技术

本发明专利技术公开了一种在人血浆中筛选的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及其制备方法和应用，提供在人血浆复杂生理环境中能够高特异性识别、高亲和力结合上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，发展了以人血浆模拟复杂生理环境的核酸适体筛选方法，可获得直接应用于外周血中捕获CTCs的核酸适体；最终获得的核酸适体具有易获得、成本低、不易失活、非免疫原性和无毒性等特点，并且利用该些序列实现了EpCAM蛋白、表达EpCAM蛋白的肿瘤细胞系的特异性识别及CTCs的捕获；另外，该些核酸适体在人血浆中具有高亲和力，确保其在生物分析和临床医学中的应用，并有望作为CTCs检测的分子识别工具而应用于液体活检。

A nucleic acid aptamer of epithelial cell adhesion molecule EpCAM screened in human plasma and its preparation method and Application

【技术实现步骤摘要】
一种在人血浆中筛选的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及其制备方法和应用
本专利技术属于生物分析和临床医学
，具体涉及一种在人血浆中筛选的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及其制备方法和应用。本专利技术具体提供了在人血浆复杂生理环境中能够高特异性识别、高亲和力结合上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体与其筛选方法及其在生物分析和临床医学中的应用，并有望作为循环肿瘤细胞检测的分子识别工具而应用于液体活检。
技术介绍
癌症已严重威胁人类生存和健康，成为全球死亡的主要原因。针对癌症的早期诊断和预后评估是提高患者生存率的重要保障。传统的癌症体外检测是组织活检，但是存在着取样困难、侵入性大等不足，难以满足临床需要。目前，针对循环肿瘤细胞(CirculatingTumorCells，CTCs)的液体活检尤为受到关注。CTCs是指由实体肿瘤组织脱落并释放进入外周血循环的肿瘤细胞，其可提供肿瘤病灶的基因组变异、细胞形态与功能改变等信息，更能全面反映肿瘤病灶的分子病理信息。与经典组织活检相比，基于CTCs检测的液体活检技术具有侵入性小、无放射性污染、成本低等优势，已成为目前最具发展潜力的肿瘤无创诊断手段之一。大量研究证明，CTCs的检测在肿瘤诊断、动态监测、预后评估等方面具有重大意义。上皮细胞粘附分子EpCAM在大部分上皮肿瘤细胞中过表达，在上皮癌变过程中发挥着作用，参与调节细胞粘附、细胞迁移、增殖和分化等功能，是一种腺癌通用肿瘤标志物。利用CTC表面表达的EpCAM，通过抗原抗体反应来捕获和分选CTCs，在肿瘤诊断、动态监测、预后评估等方面具有重大意义。例如，目前美国食品药物管理局批准的循环肿瘤细胞捕获平台Cellsearch就是基于EpCAM抗体修饰的磁珠来捕获全血中的CTCs，实现CTCs的分离富集。但是由于EpCAM抗体存在不稳定、易失活、成本高、寿命短以及大尺寸等缺点，导致CTCs的捕获效果不甚理想。因此，需要更小、更稳定和更有效的CTCs标志物的结合配体进行CTCs捕获。核酸适体，是一种寡核苷酸，通过体外指数富集配体系统进化技术(SELEX)从人工合成的DNA、RNA文库中筛选得到，经折叠形成特定的三维或者四维结构后，可与靶标分子，例如与多肽、蛋白质、药物、有机和无机分子甚至全细胞，高亲和性、特异地结合。相比于抗体，核酸适体具有易获得、成本低、纯度高、不易失活、更稳定、非免疫原性和无毒性等特点。且因核酸适体比抗体小10～20倍，因此在相同表面积下可修饰更多的识别分子，从而进一步提高CTCs捕获效率。由于核酸适体具有上述特性以及结构可调等特点，用核酸适体取代传统抗体具有巨大的优势，可实现特异性捕获CTCs，有望获得较高的CTCs捕获效率。但是，传统核酸适体筛选方法所筛选出的核酸适体，应用于复杂生理环境中捕获循环肿瘤细胞时，易受到反应体系的影响，核酸适体二级、三级结构不稳定，而导致亲和力稳定性不好，难以实现真实样品中CTCs的高效捕获。为实现核酸适体直接用于血液中富集CTCs，需要建立新型高效可用于复杂生理环境的核酸适体筛选方法，筛选针对CTCs标志物上皮细胞粘附分子EpCAM且在人血浆等复杂生理环境中更稳定、亲和力和选择性更高的核酸适体，实现CTCs特异性识别，提高CTCs捕获效率，对于肿瘤诊断、动态监测、预后评估等都具有重要意义。
技术实现思路
本专利技术的目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种在人血浆中筛选的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体及其制备方法和应用，针对当前传统的核酸适体筛选方法所得的核酸适体在复杂生理环境中捕获CTCs时存在的问题，本专利技术以人血浆模拟复杂生理环境，构建上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的筛选平台；在核酸适体筛选进化过程中，淘汰在复杂生理环境中亲和力差的序列，富集能在复杂生理环境中具有高特异性、高亲和力且稳定性好的核酸适体序列，获得可直接应用于外周血中捕获的核酸适体序列，从而建立新型高效可用于复杂体系的核酸适体筛选方法。最终获得的核酸适体具有易获得、成本低、不易失活、非免疫原性和无毒性等特点，并且利用该条序列实现了EpCAM蛋白、表达EpCAM蛋白的肿瘤细胞系的特异性识别，CTCs的捕获；另外，在人血浆中具有高亲和力，确保其在生物分析和临床医学中的应用，并有望作为CTCs检测的分子识别工具而应用于液体活检。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之一是：一种上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体包括如SEQIDNo.1至SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。具体为：SEQIDNo.1，命名为HMJ1：5'-AGCGTCGAATACCACTACAGCTGGGGGTTTCTGGGGTTTTTGTTGGGGTGGGTGTTGTGTCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3SEQIDNo.2，命名为HMJ2：5'-AGCGTCGAATACCACTACAGGAGCTCGGGGTTTGGGGGTTCGGGGTCGGTTCGGTTTCTTCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'SEQIDNo.3，命名为HMJ3：5'-AGCGTCGAATACCACTACAGCTTTCGGGGTCGTGTTTGGGGTGGGTCTTTTGGGGGTTTGCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'SEQIDNo.4，命名为HMJ4：5'-AGCGTCGAATACCACTACAGTGTTTGGGTTGGTTGGGGGTGGGTTTGGGATTTGGTGTTGCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'SEQIDNo.5，命名为HMJ5：5'-AGCGTCGAATACCACTACAGTTTGGCTCTGGGGGTTGTGGAGGGGGTATGGGTGGGAGTCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'SEQIDNo.6，命名为HMJ6：5'-AGCGTCGAATACCACTACAGGTATTCGAGTTGCTTGGGGTTGGTGGGTGGGTTCCTGTCTCTAATGGAGCTCGTGGTCAG-3'SEQIDNo.7，命名为HMJ2C：5'-TCGGGGTTTGGGGGTTCGGGGTCGGTTCGGTTTCTTCTAATGGA-3'优选地，所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体为如SEQIDNo.7所示的核苷酸序列HMJ2C。一实施例中：还包括基于上述序列做截短或部分碱基替换的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体。一实施例中：所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体具有茎环结构。本专利技术解决其技术问题所采用的技术方案之二是：一种上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，包括：1)相比于传统的在缓冲溶液中进行筛选的筛选方法，不同之处在于，是以人血浆模拟复杂生理环境，构建上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的筛选平台。具体为：首先化学合成如SEQIDNo.8所示的80个碱基的DNA初始文库；真核表达融合蛋白His-EpCAM，通过His与Ni的亲和相互作用，将EpCAM蛋白固定在Ni琼脂糖微球(Beads)上，得到EpCAM蛋白琼脂糖微球；接着在人血浆的环境中，以EpCAM蛋白琼脂糖微球为靶标，以Ni琼脂糖微球为反筛(在第三轮筛选之后引入反本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，其特征在于：所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体包括如SEQ ID No.1至SEQ ID No.7所示的核苷酸序列。

【技术特征摘要】
1.一种上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，其特征在于：所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体包括如SEQIDNo.1至SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。2.根据权利要求1所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，其特征在于：所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体为如SEQIDNo.7所示的核苷酸序列。3.根据权利要求1所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体，其特征在于：所述上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体具有茎环结构。4.一种权利要求1至3中任一项所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，其特征在于：包括：1)合成DNA初始文库；在人血浆的环境中，以EpCAM蛋白琼脂糖微球为靶标，对DNA初始文库进行筛选，得到与EpCAM蛋白琼脂糖微球特异结合的DNA序列；2)将步骤1)所得的DNA序列进行聚合酶链式反应扩增，PCR扩增产物分离、变性、过滤、纯化，即得用于下一轮筛选的次一级单链DNA文库；3)将步骤2)所得的次一级单链DNA文库进行下一轮筛选，重复多轮筛选，在多轮筛选进化过程中，淘汰在人血浆环境中亲和力差的序列，富集能在人血浆环境中具有高特异性、高亲和力且稳定性好的序列，经过多轮筛选后获得富集文库；4)对最终得到的富集文库进行测序，得到与上皮细胞粘附分子EpCAM特异结合的候选核酸适体序列，通过流式细胞术测定候选核酸适体序列与EpCAM蛋白、表达EpCAM蛋白的肿瘤细胞系的结合能力以及解离常数，甄定出其中结合能力最佳且稳定性最好的序列；5)在保证核酸适体原有的亲和力和选择性基本不变的前提下，利用NUPACK对步骤4)得到的核酸适体进行二级结构的模拟，对核酸适体的碱基组成和空间结构进行分析，再对序列进行截短优化，得到最优序列。5.根据权利要求4所述的上皮细胞粘附分子EpCAM的核酸适体的制备方法，其特征在于：还包括：6)通过流式细胞术测定最优序列与表达EpCAM蛋白的肿瘤细胞系的结合能力...

【专利技术属性】
技术研发人员：杨朝勇，黄梦娇，宋彦龄，黄培烽，陈小锋，朱志，
申请(专利权)人：厦门大学，
类型：发明
国别省市：福建,35