一种ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统及其制备方法技术方案

本发明专利技术属生物技术领域，体涉及一种ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统及其制备方法。本发明专利技术利用ROS敏感的小分子交联剂对低分子量的聚乙烯亚胺进行交联，形成ROS敏感的阳离子型聚合物，同时修饰上SP多肽作为靶向功能基团，介导与基因复合后形成的纳米粒靶向进入乳腺癌肿瘤部位，并在肿瘤细胞内高水平的ROS氛围下，交联聚合物响应性解离成小分子，释放负载的基因发挥作用，最终实现对基因的有效递送。本发明专利技术提供了一种新的基因递送平台，基因转染效果好，且通过递送治疗基因siPlk1能有效抑制肿瘤生长。

【技术实现步骤摘要】
一种ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统及其制备方法
：本专利技术属生物
，具体涉及一种ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统。
技术介绍
：文献报道，恶性肿瘤目前已成为威胁人类健康的头号敌人，传统的治疗手段包括手术切除，化疗，放疗都存在各自的缺陷：手术难以全部切除，甚至有的肿瘤由于位置特殊无法进行手术切割；化疗往往伴随全身毒副作用和机体耐药；放疗也会造成对正常组织的损伤和带来某些免疫反应。基因治疗通过将外源性基因导入宿主细胞，期望纠正或替换人体自身基因结构或功能上的紊乱，阻止疾病的进一步发生发展，由于特异性高，针对性强，很少伴有毒副反应。研究显示，基因治疗的效果主要取决于递送载体的递送效率，一个理想的载体需要具备以下三点：1)良好的生物相容性；2)基因负载能力强以保证体内运输的稳定性；3)靶向递送到病灶，同时满足以上三点，对于载体设计来说当前仍具有挑战。基因负载能力强，要求载体是荷正电的大分子，而在进入细胞后，载体最好能解离成小分子，一方面既利于基因的分离释放，另一方面又实现了材料的胞内降解，降低细胞毒性。针对以上现状，本专利技术拟提出的策略是设计一种针对肿瘤微环境响应解离的阳离子聚合物。据报道，若干疾病包括肿瘤，神经退行性疾病，炎症，心血管疾病等都伴随着氧化应激与抗氧化水平的失调从而导致ROS水平的升高，比如，肿瘤细胞内的ROS含量(100×10-6M)就远远高于正常组织(20×10-9M)，可以用来设计ROS响应的智能化载体。研究显示类似苯硼酸酯的结构能被ROS特异性切断，因此在本专利技术中，本申请的专利技术人拟设计合成一个具有苯硼酸酯结构的小分子linker，利用它对低分子量的聚乙烯亚胺阳离子单体进行交联，形成一种ROS敏感的阳离子聚合物，该技术方案将保证载体能将基因压缩成为稳定的纳米粒，且在肿瘤细胞内高水平ROS的氛围下降解为小分子，释放基因。
技术实现思路
：本专利技术的第一目的是针对现有基因递送载体所面临的挑战，提供一种新的高效的基因递送载体，具体涉及一种ROS敏感的肿瘤靶向基因递送载体及其制备方法。本专利技术提出了一种针对肿瘤微环境响应解离的阳离子聚合物。更具体的本专利技术设计合成一个具有苯硼酸酯结构的小分子linker，利用它对低分子量的聚乙烯亚胺阳离子单体进行交联，形成一种ROS敏感的阳离子聚合物，该技术方案将保证载体能将基因压缩成为稳定的纳米粒，且在肿瘤细胞内高水平ROS的氛围下降解为小分子，释放基因；此外，通过聚乙二醇，在聚合物表面共价连接一个能够靶向乳腺癌表面高表达的NK-1受体的SP肽，提高载体对基因的靶向递送能力，增加基因在肿瘤部位的蓄积。本专利技术所述递释系统由ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体和质粒DNA或siRNA复合制得。优选地，所述递释系统中，阳离子聚合物基因压缩载体与质粒DNA的N/P比例比为10∶1，与siRNA的N/P比例为3∶1。优选地，所述ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体由ROS敏感的阳离子聚合物，聚乙二醇，SP肽三者共价连接制得。优选地，所述ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体中，所述阳离子聚合物所占质量分数为70％。优选地，所述ROS敏感的阳离子聚合物由单体为分子量1200的分枝状乙烯亚胺低聚物，通过小分子交联剂VPBE交联聚合制得。优选地，所述聚乙二醇为直链聚乙二醇，其封端基团为NHS活性酯和马来酰亚胺，其分子量为3500。优选地，所述SP肽为靶向功能分子，序列为RPKPQQFFGLM，并在氨基末端修饰上巯基。优选地，所述质粒DNA为红荧光报告质粒，所述治疗基因siRNA特异性作用于polo样激酶1(Plk1)。优选地，所述ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于所述的ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体与质粒DNA复合形成的纳米复合物粒径为151.83±15.03纳米，与siRNA复合形成的纳米复合物粒径为90.3±5.87纳米。优选地，所述ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于所述ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体与质粒DNA复合形成的纳米复合物在纯水中电势为18.7±2.0毫伏。本专利技术的另一目的在于提供ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统的制备方法，其包括：1)制备ROS敏感小分子交联剂VPBE；2)VPBE与聚乙烯亚胺交联反应得到crosslinkedBPEI阳离子聚合物；3)制备SP-聚乙二醇与crosslinkedBPEI共价连接得到靶向压缩材料SP-crosslinkedBPEI；4)靶向压缩材料SP-crosslinkedBPEI水溶液慢慢滴加到基因溶液中，移液枪快速吹打后涡旋30秒，室温静置30分钟，得ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统。优选地，所述ROS敏感小分子交联剂VPBE的合成方法，其特征为：加入摩尔比为1∶1.5的4-乙烯基苯硼酸，3-烯丙氧基-1，2-丙二醇和1克无水硫酸钠于无水二氯甲烷中，在40度油浴中搅拌至过夜，通过过滤除去无水硫酸钠，最后通过柱层析硅胶柱以石油醚/乙酸乙酯3∶1的比例分离纯化得到最终产物VPBE。优选地，所述VPBE与聚乙烯亚胺交联反应方法，其特征为：对低分子量的聚乙烯亚胺进行巯基修饰，加入摩尔比为1∶2的聚乙烯亚胺和硫化丙烯于适量甲醇溶液中，氮气保护，在60度条件下反应12小时，旋蒸除掉甲醇，乙醚沉淀三次纯化得到巯基修饰的聚乙烯亚胺。接着按摩尔比1∶5将巯基修饰后的聚乙烯亚胺和VPBE，以及催化量的2，2-二甲氧基-苯基乙酮，置于甲醇中，在365纳米紫外光照射下巯基与双键click反应12小时，乙醚沉淀三次，透析袋(分子量10000)透析纯化得到crosslinkedBPEI阳离子聚合物。优选地，所述SP-聚乙二醇与crosslinkedBPEI共价连接方法，其特征为：NHS-PEG3.5K-MAL与巯基功能化的SP肽按照摩尔比1∶1.5在PBS缓冲液(pH7.0)中室温过夜反应，透析(分子量3000)24小时纯化，冷冻干燥得到SP-PEG-NHS。最后交联后的聚乙烯亚胺与SP-PEG-NHS按照摩尔比1∶1在PBS缓冲液(pH8.0)室温反应12小时，透析(分子量10000)纯化得到最终的靶向压缩材料SP-crosslinkedBPEI。优选地，所述步骤4)中的基因溶液浓度为200μg/mL。本专利技术突出的优点及特征在于，利用肿瘤微环境区别正常组织所呈现出来的高水平ROS的病理特征，设计合成了ROS敏感的阳离子聚合物基因递送载体，具有以下特点：1)对基因的稳定压缩体内运输；2)在进入肿瘤细胞后，随着聚合物载体在ROS的帮助下降解成小分子的单体，成功降低细胞毒性，生物相容性好；3)相比于传统的大分子基因载体，由于阳离子聚合物载体降解为小分子，负载的基因容易更好地离去发挥自身作用；4)靶向功能分子SP肽的修饰，通过与乳腺癌细胞上高表达的NK-1受体的识别配对，介导纳米粒靶向进入到肿瘤部位，增加基因药物在肿瘤细胞的蓄积，实现更好的肿瘤治疗效果。本专利技术的一种ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统为基因药物的安全高效递送提高了一个新的可实施途径。附图说明：图1为SP-crosslinkedBPEI在重水中的核磁氢谱图。图2为各载体与pDNA复合形成纳米粒的表征，其中，A为各载体与pDNA以不同N/P比复合形成纳米粒的粒径；本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于，所述基因递释系统由以下组分：ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体和质粒DNA或siRNA复合制得。

【技术特征摘要】
1.一种ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于，所述基因递释系统由以下组分：ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体和质粒DNA或siRNA复合制得。2.按权利要求1所述的ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于，所述的ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体由ROS敏感的阳离子聚合物，聚乙二醇，SP肽三者共价连接制得，其中，阳离子聚合物所占质量分数为70％，整个压缩材料与质粒DNA的N/P比例比为10∶1，与siRNA的N/P比例为3∶1。3.按权利要求2所述的ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于，所述的ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体中的阳离子聚合物由分枝状乙烯亚胺低聚物通过小分子交联剂VPBE交联聚合制得。4.按权利要求2所述的ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于，所述的ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体中，聚乙二醇为直链聚乙二醇，于其封端基团为NHS活性酯和马来酰亚胺，其分子量为3500。5.按权利要求2所述的ROS敏感的肿瘤靶向基因递释系统，其特征在于，所述的ROS敏感的阳离子聚合物基因压缩载体中，SP肽为靶向功能分子，序列为RPKPQQFFGLM，并在氨基末端修饰上巯基。6.按权利要求1所述的ROS敏感的肿瘤靶向基因递释...

【专利技术属性】
技术研发人员：阮春晖，孙涛，蒋晨，
申请(专利权)人：复旦大学，
类型：发明
国别省市：上海,31