用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物及其制备和应用制造技术

本发明专利技术涉及一种用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：将胍基化两亲性壳聚糖衍生物溶于无RNA酶的水相溶液中得到阳离子胶束溶液A；将目的microRNA溶于无RNA酶的水相溶液中，得到溶液B；其中，胍基化两亲性壳聚糖衍生物包括亲水片段，亲水片段连接有疏水片段和穿膜官能团分子，亲水片段为亲水性的壳聚糖或壳聚糖衍生物，穿膜官能团分子为含胍基的脂肪酸；目的microRNA为结肠癌中低表达的microRNA；将阳离子胶束溶液A和溶液B混合均匀，并在35‑40℃下静置孵育20‑30分钟。本发明专利技术的纳米复合物中，阳离子胶束通过离子静电相互作用吸附microRNA，形成具有结肠癌被动靶向递送microRNA功能的纳米复合物，具有制备过程简便，microRNA包载效率高，靶向转染效率高等优点。

MicroRNA nanocomposites for the treatment of colon cancer and their preparation and Application

The present invention relates to a method for preparing microRNA nanocomposites for the treatment of colon cancer, which includes the following steps: dissolving guanidinated amphiphilic chitosan derivatives in an aqueous solution without RNA enzyme to obtain cationic micelle solution A; dissolving target microRNA in an aqueous solution without RNA enzyme to obtain solution B; and guanidinated amphiphilic chitosan derivatives include hydrophilic fragments and hydrophilic fragments. Water fragments are connected with hydrophobic fragments and transmembrane functional group molecules. The hydrophilic fragments are hydrophilic chitosan or chitosan derivatives. The transmembrane functional group molecules are guanidine-containing fatty acids. Aim MicroRNA is a microRNA with low expression in colon cancer. Cationic micelle solution A and solution B are mixed evenly and incubated at 35 40 C for 20 30 minutes. In the nanocomposite of the invention, cationic micelles adsorb microRNA through ion electrostatic interaction to form a nanocomposite with the function of passive targeting delivery of microRNA for colon cancer, which has the advantages of simple preparation process, high efficiency of microRNA encapsulation and high targeting transfection efficiency.

【技术实现步骤摘要】
用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物及其制备和应用
本专利技术涉及药物制剂领域，尤其涉及一种用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物及其制备和应用。
技术介绍
大肠癌是一种常见的恶性肿瘤，由于饮食结构和生活方式改变，中国、日本等东方国家大肠癌发病率都有增加的趋势。多数研究认为，大肠癌发病率上升的原因与高脂肪饮食和运动不足等生活方式的改变相关。目前，治疗大肠癌的治疗多采用化疗药物，但缺乏针对大肠癌的靶向治疗药物，使得治疗效果不佳，且对正常组织常常造成不可逆转的损伤。肿瘤基因治疗是将治疗性核酸引入细胞中以修正基因信息逐渐成为基因水平治疗癌症的有效方法。microRNA(miRNA)是一类由内源基因编码的长度约为22个核苷酸的非编码单链RNA分子，可以参与转录后基因表达调控，成为基因治疗药物的重要组成部分。目前，大规模临床样本分析表明大肠癌患者体内miR-150低表达与患者的生存期较短相关，且此类病人对手术后化疗的敏感性较差。miR-150类似物(mimics)的有效转染可抑制大肠癌细胞的增殖，并诱导癌细胞的程序性死亡，从而提高患者生存期，并改善患者对手术后化疗的敏感性。然而，miRNA体内递送过程会遇到很多障碍，比如易被体内核酸酶、酯酶降解，难以透过细胞膜等。壳聚糖又称脱乙酰甲壳素，是一种天然的高分子聚合物，由于其生物相容性和生物可降解性，常被用于负载基因形成聚合物/基因复合物，从而实现基因的体内递送。壳聚糖及其衍生物介导的基因递送具有诸多优势：1.壳聚糖及其衍生物与基因类药物复合操作简易，只需要简单混匀即可通过静电吸附作用与药物自组装成微粒；2.壳聚糖及其衍生物含有活性氨基，表面可修饰多种功能化基团，以改善载体性质或发挥不同生物学作用。然而，壳聚糖及其衍生物通常表面电荷密度较低，对核酸类药物的荷载能力较弱，且没有较强的内涵体逃逸功能，对核酸类药物递送效率较低。
技术实现思路
为解决上述技术问题，本专利技术的目的是提供一种用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物及其制备和应用，本专利技术的纳米复合物中，阳离子胶束通过离子静电相互作用吸附microRNA，形成具有结肠癌被动靶向递送microRNA功能的纳米复合物，具有制备过程简便，microRNA包载效率高，靶向转染效率高等优点。本专利技术是通过下列技术方案实现的：本专利技术的第一个目的是提供一种用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物的制备方法，包括以下步骤：(1)将胍基化两亲性壳聚糖衍生物溶于无RNA酶的水相溶液中得到阳离子胶束溶液A；将目的microRNA溶于无RNA酶的水相溶液中，得到溶液B；其中，所述胍基化两亲性壳聚糖衍生物包括亲水片段，所述亲水片段连接有疏水片段和穿膜官能团分子，所述亲水片段为亲水性的壳聚糖或壳聚糖衍生物，所述穿膜官能团分子为含胍基的脂肪酸；所述目的microRNA为结肠癌中低表达的microRNA；(2)将所述阳离子胶束溶液A和溶液B混合均匀，并在25-37℃静置孵育20-30分钟，得到所述用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物。进一步地，在步骤(1)中，所述阳离子胶束溶液A中，胍基化两亲性壳聚糖衍生物的浓度为0.1mg/mL-5mg/mL。进一步地，在步骤(1)中，所述溶液B中，目的microRNA的浓度为5-100μg/mL。优选地，溶液B中，目的microRNA的浓度为10-20μg/mL。进一步地，在步骤(1)中，亲水片段为分子量为10000Da以下的低分子壳聚糖、羟乙基壳聚糖或其衍生物。进一步地，在步骤(1)中，所述穿膜官能团分子为胍基乙酸、胍基丙酸和胍基丁酸中的一种或几种。进一步地，在步骤(1)中，所述疏水片段为聚乳酸或C4-C18长链脂肪酸。优选地，聚乳酸的分子量为2000-2.5×104Da。进一步地，在步骤(1)中，所述胍基化两亲性壳聚糖衍生物中，所述亲水片段分子量为5×102-1×106Da，所述疏水片段的摩尔取代度为3-50％，所述穿膜官能团分子的摩尔取代度为5-50％。进一步地，在步骤(1)中，所述目的microRNA为miR-150和/或miR-150类似物。其具有抑制结肠癌发生和发展的作用。进一步地，miR-150类似物的核苷酸序列如下：5'-UCUCCCAACCCUUGUACCAGUG-3'。本专利技术用于荷载microRNA的阳离子胶束，是由胍基化两亲性壳聚糖衍生物在水相中自组装形的。具体的是利用胍基化功能分子以及疏水分子对壳聚糖或其衍生物母体聚合物进行共修饰，得到两亲性衍生物能在水中自组装形成具有高表面正电荷密度及其穿膜效应的阳离子胶束，能有效通过静电作用荷载microRNA得到纳米复合物。给药后纳米复合物通过结肠癌的高渗透性和滞留效应被动蓄积到肿瘤部位被靶细胞摄取并有效溶酶体逃逸实现高效的microRNA分子转染。进一步地，在步骤(1)中，所述胍基化两亲性壳聚糖衍生物的制备方法包括以下步骤：在反应溶剂中，通过酰胺化反应分别将所述穿膜官能团分子和疏水片段接枝到所述亲水片段上；其中，反应在活化剂存在下进行，所述活化剂为1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和羟基琥珀酰亚胺或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑；反应在pH值为7.4-8的条件下进行。穿膜官能团分子和疏水片段接枝到所述亲水片段上无先后顺序。进一步地，反应溶剂为水、甲醇、二甲基亚砜、甲酰胺、N,N-二甲基甲酰胺、水与甲醇的混合溶剂、水与二甲基亚砜的混合溶剂、水与甲酰胺的混合溶剂或甲酰胺与N,N-二甲基甲酰胺的混合溶剂。更具体地，上述胍基化两亲性壳聚糖衍生物的制备方法，包括以下步骤：S1)将亲水片段溶于反应溶剂中，向其中加入穿膜官能团分子，以1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑(HOBT)为活化剂进行酰胺化反应，得到反应中间体；S2)将反应中间体和疏水片段溶于反应溶剂中，1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和羟基琥珀酰亚胺(NHS)或1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺和1-羟基苯并三唑为活化剂进行酰胺化反应，得到胍基化两亲性壳聚糖衍生物。此外，也可以将S1)中的穿膜官能团分子和S2)中的疏水片段相互调换。进一步地，在步骤(2)中，阳离子胶束溶液A中的胍基化两亲性壳聚糖衍生物和溶液B中的microRNA的质量比为0.1mg-5mg:5-100μg。本专利技术的第二个目的是提供一种采用上述制备方法所制备的用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物。该纳米复合物的粒径为40-500nm，其中的microRNA的包封率为80％-100％。本专利技术的第三个目的是公开上述用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物在制备结肠癌基因治疗靶向药物中的应用。借由上述方案，本专利技术至少具有以下优点：本专利技术的纳米复合物制备过程中，阳离子聚合物胶束能利用静电作用吸附并压缩microRNA形成纳米复合物，该纳米复合物可通过被动靶向性实现对结肠癌的蓄积。本专利技术以胍基化两亲性壳聚糖衍生物作为microRNA载体，能通过较强的正电性以及磷脂双分子层穿透性实现对目的microRNA的有效荷载和转染。本专利技术所用的纳米复合物形成的原料均生物本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将胍基化两亲性壳聚糖衍生物溶于无RNA酶的水相溶液中得到阳离子胶束溶液A；将目的microRNA溶于无RNA酶的水相溶液中，得到溶液B；其中，所述胍基化两亲性壳聚糖衍生物包括亲水片段，所述亲水片段连接有疏水片段和穿膜官能团分子，所述亲水片段为亲水性的壳聚糖或壳聚糖衍生物，所述穿膜官能团分子为含胍基的脂肪酸；所述目的microRNA为结肠癌中低表达的microRNA；(2)将所述阳离子胶束溶液A和溶液B混合均匀，并在25‑37℃下静置孵育20‑30分钟，得到所述用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物。

【技术特征摘要】
1.一种用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)将胍基化两亲性壳聚糖衍生物溶于无RNA酶的水相溶液中得到阳离子胶束溶液A；将目的microRNA溶于无RNA酶的水相溶液中，得到溶液B；其中，所述胍基化两亲性壳聚糖衍生物包括亲水片段，所述亲水片段连接有疏水片段和穿膜官能团分子，所述亲水片段为亲水性的壳聚糖或壳聚糖衍生物，所述穿膜官能团分子为含胍基的脂肪酸；所述目的microRNA为结肠癌中低表达的microRNA；(2)将所述阳离子胶束溶液A和溶液B混合均匀，并在25-37℃下静置孵育20-30分钟，得到所述用于治疗结肠癌的microRNA纳米复合物。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述阳离子胶束溶液A中，胍基化两亲性壳聚糖衍生物的浓度为0.1mg/mL-5mg/mL。3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述溶液B中，目的microRNA的浓度为5-100μg/mL。4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：在步骤(1)中，所述穿膜官能团分子为胍基乙酸、胍基丙酸和胍基丁酸中的一种或几种。5.根据权利要求1所述的...

【专利技术属性】
技术研发人员：常英，张彩华，霍美蓉，廉云飞，殷婷婕，褚旭新，
申请(专利权)人：上海珑欣生物医学科技有限公司，
类型：发明
国别省市：上海,31