用于治疗视网膜变性的基于CRISPR/CAS9的组合物和方法技术

本文描述的是用于治疗主体中的视网膜变性的方法，所述视网膜变性例如利伯氏先天性黑蒙（LCA）、视网膜色素变性（RP）和青光眼。本文还提供的是改变细胞（例如视网膜神经节细胞）中的一种或多种基因产物的表达的方法。此类方法可以包括利用在单个紧凑的腺伴随病毒（AAV）颗粒中包装的修饰的核酸酶系统，例如包含双向H1启动子和针对视网膜变性相关基因的gRNA的成簇规律间隔短回文重复（CRISPR）系统。

Composition and method based on CRISPR/CAS9 for treatment of retinal degeneration

This article describes a method for the treatment of retinal degeneration in the subject, such as Lieber's congenital amaurosis (LCA), retinitis pigmentosa (RP) and glaucoma. This article also provides a method for altering the expression of one or more gene products in cells, such as retinal ganglion cells. Such methods may include the use of modified nuclease systems encapsulated in a single compact adeno-associated virus (AAV) particle, such as a short palindrome repeat (CRISPR) system containing bidirectional H1 promoter and gRNA clustering rules targeting retinal degeneration-related genes.

【技术实现步骤摘要】
【国外来华专利技术】用于治疗视网膜变性的基于CRISPR/CAS9的组合物和方法交叉引用本申请要求于2016年7月5日提交的美国临时申请号62/358,337的权益，所述美国临时申请的全部内容在此通过引用并入。背景视网膜变性是尤其包括利伯氏先天性黑蒙（LCA）、视网膜色素变性（RP）和青光眼的一组病症。LCA是可遗传形式的视网膜变性，其特征在于在生命的前几个月期间严重的视网膜功能障碍和严重的视力损害。LCA是罕见疾病（影响少于200,000美国人的疾病），但LCA的18种亚型一起是遗传性失明的最常见原因。指定LCA10的亚型是最常见的亚型，占所有LCA病例的>20%。某些形式的LCA顺应通过重组腺伴随病毒（AAV）的治疗，所述重组腺伴随病毒（AAV）经改造为递送缺陷型细胞基因的功能性拷贝。在2008年，在I期临床试验中，将补充RPE65中的突变的转基因通过AAV成功地递送至LCA2患者（MaguireAM等人NEnglJMed.2008；358（21）:2240-2248）。注意到一些应答，但这些应答不是持久的，因为转基因表达最终丧失（SchimmerJ等人HumGeneTherClinDev.2015；26（4）:208-210；AzvolinskyA.NatBiotechnol.2015；33（7）:678-678）。此外，引起不同LCA亚型的一些基因对于AAV递送而言简直太大。因此，这些LCA亚型仍然无法治愈。ADRP构成所有RP病例的大约30-40%，并且在ADRP患者中，最常见的突变RP相关基因是编码视杆视色素视紫红质的基因（Dryja，T.P.等人TheNewEnglandjournalofmedicine323，1302-1307（1990）；Dryja，T.P.等人Nature343，364-366（1990））。目前，不存在FDA批准的用于ADRP患者的治疗；然而，许多方法正在开发中。这些方法中的大多数是关于“抑制和替代”主题的变化。在这种方法中，敲低负责变性的基因的表达，例如用核酶或经由RNA干扰（RNAi）敲低视紫红质RNA的水平（shRNA和siRNA方法两者正在探索中），然后用“硬化的”基因替代内源等位基因的表达，所述“硬化的”基因不易被核酶或RNAi试剂敲低。可能最接近临床的这一主题的变体是由GenableTechnologiesLimited开发的RhoNova试剂。RhoNova采用siRNA来敲低与AAV递送的cDNA组合的内源性视紫红质表达（突变体和野生型两者），所述cDNA编码不易被siRNA敲低的经修饰的但功能性视紫红质（http://www.genable.net）。青光眼，全世界不可逆失明的首因（Levkovitch-VerbinH等人iovsorg44，3388–3393（2003）），是视神经病变，其中在视神经头的筛板（laminacribosa）处的视网膜神经节细胞（RGC）轴突的进行性损伤导致轴突变性和细胞死亡（HowellGR等人JCellBiol179，1523–1537（2007））。目前，唯一的治疗，无论是通过滴眼液、激光还是切口手术，都是降低眼内压（IOP）并且减少在视神经头处的损伤。不幸的是，这在一些患者中是困难的，而在其他患者中，尽管侵袭性IOP降低，该疾病仍可继续恶化。该领域长期以来需要替代治疗策略，其通过减轻对残余轴突损伤的RGC应答来补充IOP降低。此外，NEI已将视神经再生列为其大胆的目标（AudaciousGoal），并且任何再生疗法都必须解决视神经切断的RGC存活的问题。为此，非常需要开发可能直接干扰RGC轴突变性和/或轴突损伤相关细胞死亡的活跃遗传程序的神经保护剂（AdalbertR等人Science（2012），doi:10.1126/science.1223899；YangJ等人Cell160，161–176（2015）；WelsbieDS等人ProcNatAcadSciUSA110，4045–4050（2013）；WatkinsTA等人ProcNatAcadSciUSA110，4039–4044（2013））。因此，非常需要用于治疗视网膜变性如LCA、ADRP和青光眼的新型和改进的疗法。专利技术概述除非另有说明，否则本专利技术的实践通常采用细胞生物学、细胞培养、分子生物学、转基因生物学、微生物学、重组核酸（例如DNA）技术、免疫学和RNA干扰（RNAi）的常规技术，所述常规技术在本领域的技术内。这些技术中的某些的非限制性描述在下述出版物中发现：Ausubel，F.，等人（编辑），CurrentProtocolsinMolecularBiology、CurrentProtocolsinImmunology、CurrentProtocolsinProteinScience和CurrentProtocolsinCellBiology，均为JohnWiley&Sons，N.Y.，截止2008年12月的版本；Sambrook，Russell和Sambrook，MolecularCloning.ALaboratoryManual，第3版，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，2001；Harlow，E.和Lane，D.，Antibodies—ALaboratoryManual，ColdSpringHarborLaboratoryPress，ColdSpringHarbor，1988；Freshney，R.I.，“CultureofAnimalCells，AManualofBasicTechnique”，第5版，JohnWiley&Sons，Hoboken，N.J.，2005。关于治疗剂和人类疾病的非限制性信息可在GoodmanandGilman'sThePharmacologicalBasisofTherapeutics，第11版，McGrawHill，2005，Katzung，B.（编辑）BasicandClinicalPharmacology，McGraw-Hill/Appleton&Lange第10版（2006）或第11版（2009年7月）中找到。关于基因和遗传病症的非限制性信息在以下中找到：McKusick，V.A.:MendelianInheritanceinMan.ACatalogofHumanGenesandGeneticDisorders.Baltimore:JohnsHopkinsUniversityPress，1998（第12版）或更近的在线数据库：OnlineMendelianInheritanceinMan，OMIM™.McKusick-NathansInstituteofGeneticMedicine，JohnsHopkinsUniversity（Baltimore，Md.）和NationalCenterforBiotechnologyInformation，NationalLibraryofMedicine（Bethesda，Md.），截至2010年5月1日，可获自万维网：http://www.ncbi.nlm.nih.go本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种用于治疗有此需要的主体中的视网膜变性的方法，所述方法包括：（a）提供包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统，所述载体包含：i）与编码核酸酶系统指导RNA（gRNA）的至少一种核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所述gRNA与主体的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，并且其中所述DNA分子编码在细胞中表达的一种或多种基因产物；和ii）在细胞中可操作的调节元件，其与编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列可操作地连接，其中组件（i）和（ii）位于所述系统的相同或不同载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与之杂交，并且所述核酸酶切割所述DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达；和（b）向所述主体的视网膜区域施用治疗有效量的所述系统。

【技术特征摘要】
【国外来华专利技术】2016.07.05 US 62/3583371.一种用于治疗有此需要的主体中的视网膜变性的方法，所述方法包括：（a）提供包含一种或多种载体的非天然存在的核酸酶系统，所述载体包含：i）与编码核酸酶系统指导RNA（gRNA）的至少一种核苷酸序列可操作地连接的启动子，其中所述gRNA与主体的细胞中的DNA分子的靶序列杂交，并且其中所述DNA分子编码在细胞中表达的一种或多种基因产物；和ii）在细胞中可操作的调节元件，其与编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列可操作地连接，其中组件（i）和（ii）位于所述系统的相同或不同载体上，其中所述gRNA靶向所述靶序列且与之杂交，并且所述核酸酶切割所述DNA分子以改变一种或多种基因产物的表达；和（b）向所述主体的视网膜区域施用治疗有效量的所述系统。2.权利要求1的方法，其中所述系统是CRISPR。3.权利要求1的方法，其中将所述系统包装到单个腺伴随病毒（AAV）颗粒内。4.权利要求1的方法，其中所述系统使一种或多种基因产物失活。5.权利要求1的方法，其中所述核酸酶系统切除至少一个基因突变。6.权利要求1的方法，其中所述启动子是双向启动子。7.权利要求6的方法，其中所述双向启动子是H1。8.权利要求7的方法，其中所述H1启动子包含：a）提供在编码gRNA的至少一种核苷酸序列的一个方向上的转录的控制元件；和b）提供在编码基因组靶向核酸酶的核苷酸序列的相反方向上的转录的控制元件。9.权利要求1的方法，其中所述基因组靶向核酸酶是Cas9蛋白。10.权利要求9的方法，其中将所述Cas9蛋白进行密码子优化用于在细胞中表达。11.权利要求6-7中任一项的方法，其中所述启动子与至少一个、两个、三个、四个、五个、六个、七个、八个、九个或十个gRNA可操作地连接。12.权利要求1的方法，其中所述视网膜区域是视网膜。13.权利要求1的方法，其中所述细胞是视网膜感光细胞。14.权利要求1的方法，其中所述细胞是视网膜神经节细胞。15.权利要求1的方法，其中所述视网膜变性选自利伯氏先天性黑蒙（LCA）、视网膜色素变性（RP）和青光眼。16.权利要求15的方法，其中所述视网膜变性是LCA1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18。17.权利要求16的方法，其中所述视网膜变性是LCA10。18.权利要求16-17中任一项的方法，其中所述靶序列在LCA10CEP290基因中。19.权利要求16-18中任一项的方法，其中所述靶序列是CEP290基因中的突变。20.权利要求16-19中任一项的方法，其中所述靶序列选自SEQIDNO：1-109、164-356、735-738或788-1397中所示的核苷酸序列、或其组合。21.权利要求20的方法，其中所述靶序列包含可操作地连接的SEQIDNO：1、2、3和4。22.权利要求1的方法，其中所述载体包含SEQIDNO：110中所示的核苷酸序列。23.权利要求15的方法，其中所述视网膜变性是常染色体显性形式的视网膜色素变性（ADRP）。24.权利要求1的方法，其中所述一种或多种基因产物是视紫红质。25.权利要求1的方法，其中所述靶序列是视紫红质基因中的突变。26.权利要求1的方法，其中所述靶序列是在视紫红质基因的R135处的突变。27.权利要求26的方法，其中所述在R135处的突变选自R135G、R135W、R135L。28.权利要求25-27中任一项的方法，其中所述靶序列选自SEQIDNO：111-126中所示的核苷酸序列、或其组合。29.权利要求1的方法，其中所述gRNA序列选自SEQIDNO：127-142中所示的核苷酸序列、或其组合。30.权利要求15的方法，其中所述视网膜变性是青光眼。31.权利要求1的方法，其中所述一种或多种基因产物是双亮氨酸拉链激酶（DLK）、亮氨酸拉链激酶（LZK）、ATF2、JUN、性别决定区Y（SRY）-盒11（SOX11）、肌细胞增强因子2A（MEF2A）、JNK1-3、MKK4、MKK7、SOX11或PUMA、或其组合。32.权利要求1的方法，其中所述一种或多种基因产物是DLK/LZK、MKK4/7、JNK...

【专利技术属性】
技术研发人员：V贾斯库拉兰加，D扎克，F班斯，D威尔斯比，
申请(专利权)人：约翰霍普金斯大学，
类型：发明
国别省市：美国,US