一种奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法技术

本发明专利技术的用于肺癌早期诊断和治疗的奥曲肽(OCT)偶联的纳米壳聚糖(CS)分子信标(MB)，首先自组装法合成纳米壳聚糖分子信标(CS‑MB)，然后通过化学反应以戊二醛为交联剂合成奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标(CS‑MB‑OCT)，该CS‑MB‑OCT纳米复合物能够根据荧光强度动态监测肺癌的发生、发展过程，同时奥曲肽本身或此复合物通过与肿瘤细胞高表达的microRNA结合进一步抑制microRNA的表达，从而达到抑瘤目的，可应用于肺癌细胞、肺癌裸鼠肺移植瘤及早期肺癌转基因小鼠模型活体动物成像，具有靶向性强、转染效率高、特异性高、稳定性好、背景低、抑瘤率高等特点，将为肺癌的早期诊断和治疗提供新思路、新方法和新技术。

Preparation of Octreotide-Coupled Nano-Chitosan Molecular Beacon

【技术实现步骤摘要】
一种奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法
本专利技术涉及生物医药
，尤其涉及一种用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法。
技术介绍
肺癌是严重威胁人类健康的恶性肿瘤，其发病率和死亡率逐年攀升，早期诊断及早治疗是改善患者预后的关键，但是肺癌患者在病变早期往往无明显症状，就诊时大多为中晚期，丧失了治疗的最佳时机。因此从肺癌发生的“起源”着手，探寻高效、特异的早期诊断及治疗的新方法，将会对肺癌的预防、诊断及治疗产生深远的影响。肿瘤干细胞理论认为在肿瘤组织细胞中存在一群数量极少的肿瘤细胞，称为肿瘤干细胞，所有的肿瘤细胞都是由肿瘤干细胞分化来的。微小RNA(miRNA，microRNA)在肿瘤的发生发展过程中发挥重要作用，检测NSCLC干细胞相关的miRNAs是肺癌早期诊断和治疗的一个重要策略。研究表明常见的不同肿瘤类型呈现特征性的miRNAs表达谱，这将为肿瘤的组织来源和诊断提供依据，特征性的miRNA表达谱可以作为肿瘤早期诊断和治疗的分子标志物，也可判断不同肿瘤的预后、预测治疗效果。多项研究显示miR-155在NSCLC中高表达，检测肺组织内的miR-155表达水平能区分肺癌患者与非肺癌患者，而且检测肿瘤组织内的miR-155表达水平能预测患者的肿瘤复发和不良预后风险，肺癌干细胞中miR-155表达高于普通肺癌细胞。如果能够直接携带荧光物质或化疗药物靶定肺癌细胞甚至肺癌干细胞，将有望最终达到早期诊断和根治肺癌的目的。分子信标(molecularbeacon，MB)是基于荧光共振能量转移(fluorescenceresonanceenergytransfer,FRET)原理设计的一种高灵敏性和高特异性检测工具，实际上是一种呈茎环结构的双标记寡核苷酸探针，两端的核酸序列互补配对。未结合目标链时，位于其末端的荧光基团与淬灭基团紧紧靠近，荧光被淬灭；当分子信标与目标链结合时，分子信标的空间构象发生改变，荧光基团远离猝灭基团，荧光信号恢复，因此分子信标是一种特异性检测DNA和RNA靶向序列的发夹型核酸探针，可被用来进行核酸-核酸和活细胞内可视化研究。常规分子信标本身易被核酸酶或核结合蛋白降解，存在稳定性差、细胞摄取困难等缺点。而用锁核酸(1ockednucleicacid，LNA)修饰碱基，由于几何和立体性质改变，其在较高温度的环境中能稳定存在，抗核酸酶降解的能力显著增强，具有与DNA/RNA强大的杂交亲和力。利用分子信标的关键是如何获得理想的转运载体，既可有效地保护免于被降解，又可高效地将分子信标递送入宿主细胞发挥靶向识别核酸序列的功能。壳聚糖(chitosan，CS)纳米为天然阳离子多糖，体外及体内实验均证实了壳聚糖作为转移载体的安全性及有效性，其主要特点有：①组织相容性好、免疫原性低，毒性小；②荷正电，易与DNA分子自组装结合成纳米复合物，形成稳定的核壳结构，且对DNA有保护作用；③制作过程简单、温和，对DNA、抗体等生物大分子理化性质影响小；④壳聚糖纳米表面密集的活性氨基基团便于大分子修饰和耦联。目前，多肽类受体作为恶性肿瘤诊断和治疗的分子靶点已成为研究的热点，其中生长抑素受体(SSTR)就是其中的典型代表，许多肿瘤及其转移灶组织都有SSTR的表达，较正常组织明显增高，大多以表达SSTR2为主，如非小细胞肺癌、小细胞肺癌、内分泌胰腺癌、垂体瘤、淋巴瘤、脑膜瘤以及结肠、直肠、乳腺和前列腺肿瘤等。目前人工合成的SSTR类似物(SSA)经过修饰后可选择性增强和延长其生物学活性，半衰期长，作用强大，如奥曲肽(octreotide,OCT)、兰瑞肽(lanreotide)、伐普肽(vapreotide)等。SSA在体内不仅可以与肿瘤组织表达的SSTR特异性结合，而且也可以与肿瘤血管内皮细胞上的SSTR结合，进而达到双重靶向肿瘤组织的目的。除此之外，奥曲肽本身在治疗方面已被批准用于神经内分泌肿瘤、小细胞肺癌、非小细胞肺癌等具有神经内分泌性质的恶性肿瘤，表现出了良好的抗肿瘤活性。在现有技术中，已有研究表示奥曲肽(OCT)可作为药物递送系统的主动靶向基团，可以将抗肿瘤药物递送到肿瘤部位；也有报道奥曲肽放射性核素标记物被FDA批准作为肿瘤的诊断及治疗试剂。但现有技术中的分子信标或者奥曲肽等复合物制备方法复杂，工艺条件苛刻，且这些复合物只能用于诊断和治疗肺癌的中、晚期，这会使肺癌患者错过最佳治疗时间，影响肺癌患者的治疗，同时这些复合物在用于诊断肺癌的靶向性、特异性或稳定性等方面中至少有一方面效果不佳，因此急需一种制备方法简便且可获得靶向性强、特异性高、稳定性好的新思路、新方法的诊断肺癌的试剂，尤其是早期可以诊断肺癌优良试剂。
技术实现思路
本专利技术的目的是提供一种用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法，解决现有技术中用于肺癌诊断和治疗的药物或试剂的制备方法复杂、工艺条件苛刻且其靶向性、特异性或稳定性不佳以及只能诊断中、晚期肺癌的问题。本专利技术解决技术问题所采用的技术方案是：提供一种用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法，包括下述步骤：A、将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在pH6.0-7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在室温下静置40min～120min，得到纳米壳聚糖分子信标复合物；B、在纳米壳聚糖分子信标复合物中滴加0.5％～2.0％的戊二醛溶液，所述戊二醛溶液与所述纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为900：1～1300：1，通过第一次搅拌混合进行反应1h～2h，第一次搅拌速度为100rpm～300rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析0.5h～2h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为120：1～80：1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应3h～6h，第二次搅拌速度为100rpm～300rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析11h～15h去除未结合的奥曲肽，得到用于肺癌诊断和治疗的靶向奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物。在本专利技术的制备方法中，在步骤A中，所述纳米壳聚糖的粒径≤300nm。在本专利技术的制备方法中，在步骤A中，所述纳米壳聚糖与所述分子信标的质量比为7：1。在本专利技术的制备方法中，在步骤A中，所述PBS缓冲液的pH为6.0。在本专利技术的制备方法中，在步骤A中，漩涡震荡时间为60s。在本专利技术的制备方法中，在步骤B中，所述戊二醛溶液的浓度为1.0％，所述戊二醛溶液与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为1000：1。在本专利技术的制备方法中，在步骤B中，所述奥曲肽与所述纳米壳聚糖分子信标复合物的质量比为100：1。在本专利技术的制备方法中，在步骤B中，第一次搅拌混合反应时间为1.5h，第一次搅拌速度为150rpm。在本专利技术的制备方法中，在步骤B中，第二次搅拌混合反应时间为4h，第一次搅拌速度为150rpm。在本专利技术的制备方法中，在步骤B中，第一次透析时间为1h；第二次透析时间为12h。实施本专利技术的用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标复合物的制备方法，具有以下有益效果：本专利技术的用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽(OCT)偶联的纳米壳聚糖(CS)分子信标(MB)复合物，本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：A、将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在pH6.0‑7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在室温下静置40min～120min，得到纳米壳聚糖分子信标复合物；B、在纳米壳聚糖分子信标复合物中滴加0.5％～2.0％的戊二醛溶液，所述戊二醛溶液与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为900：1～1300：1，通过第一次搅拌混合进行反应1h～2h，第一次搅拌速度为100rpm～300rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析0.5h～2h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为120：1～80：1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应3h～6h，第二次搅拌速度为100rpm～300rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析11h～15h去除未结合的奥曲肽，得到用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标。

【技术特征摘要】
1.一种奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标的制备方法，其特征在于，包括下述步骤：A、将壳聚糖纳米与分子信标按照质量比7：1～10：1的比例在pH6.0-7.0的PBS缓冲液中混合，并漩涡震荡40s～120s，在室温下静置40min～120min，得到纳米壳聚糖分子信标复合物；B、在纳米壳聚糖分子信标复合物中滴加0.5％～2.0％的戊二醛溶液，所述戊二醛溶液与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为900：1～1300：1，通过第一次搅拌混合进行反应1h～2h，第一次搅拌速度为100rpm～300rpm，反应后通过微量透析柱第一次透析0.5h～2h去除未结合的戊二醛；然后按照奥曲肽与所述壳聚糖分子信标纳米复合物的质量比为120：1～80：1的比例加入奥曲肽，进行第二次搅拌混合反应3h～6h，第二次搅拌速度为100rpm～300rpm，反应后通过微量透析柱第二次透析11h～15h去除未结合的奥曲肽，得到用于肺癌诊断和治疗的奥曲肽偶联的纳米壳聚糖分子信标。2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，在步骤A中，所述壳聚糖...

【专利技术属性】
技术研发人员：朱海振，黄立敏，王姿，郭熠，朱海燕，胡建军，候净，杨飞月，蒋莹，思雪莹，江飞龙，
申请(专利权)人：贵州省人民医院，
类型：发明
国别省市：贵州,52