一种增殖细胞核抗原的偶联方法技术

本发明专利技术涉及免疫领域，具体而言，涉及一种增殖细胞核抗原的偶联方法。一种增殖细胞核抗原的偶联方法，包括以下步骤：活化的羧化微粒在醋酸盐溶液中与增殖细胞核抗原进行偶联反应。本发明专利技术提供的一种增殖细胞核抗原的偶联方法，是由发明专利技术人发现得到，选用醋酸盐溶液进行偶联，有效解决了抗原偶联效率低、偶联重复性差的问题，使目标抗原能够稳定地偶联在微粒载体上，便于应用于目标抗体的检测。

【技术实现步骤摘要】
一种增殖细胞核抗原的偶联方法
本专利技术涉及免疫领域，具体而言，涉及一种增殖细胞核抗原的偶联方法。
技术介绍
增殖细胞核抗原(PCNA)是真核生物复制复合体的核心成分，具有特殊的环状三级结构。一个PCNA分子是由3个首尾相接的同源单体组成，每个单体含有空间结构相同的两个结构域，因此每个PCNA分子有6个重复的结构域，形成一个六边对称的封闭环状。这个完整的PCNA三聚体有不同的氨基酸组成，其环状结构的内外表面具有不同的性质：其内表面由富含碱性氨基酸的α螺旋组成，每个结构域中心有两个α螺旋，这种由螺旋结构组成的内部构造使得PCNA在空间结构上既可以与DNA链双螺旋紧密环绕在一起，又可以在复制过程中自由滑动。而每个结构域外侧有九个反向平行的β折叠，将其疏水结构充分暴露，使不同功能蛋白可以通过疏水作用结合于其上，最主要的蛋白结合位点是单体内部两个结构域之间的连接部位，即位于PCNA一侧的卷曲结构，因而使得偶联过程更复杂。关于抗原或抗体与磁微粒的偶联，已有一些公开文献，如申请号为201610980451.5公开磁微粒化学发光免疫检测试剂盒及其检测方法，其涉及自身免疫疾病抗原为SS-A、核糖体P蛋白、SS-B、nRNP/Sm、Sm、着丝点、scl-70、Jo-1、双链DNA、组蛋白、核小体、线粒体2型(M2)、环瓜氨酸肽(CCP)、髓过氧化物酶(MPO)、蛋白酶3(PR3)、肾小球基底膜(GBM)、抗肝肾微粒体1型(LKM-1)、肝细胞溶质抗原1(LC-1)、可溶性肝抗原(SLA/LP)、PM-SCL、增殖细胞核抗原(PCNA)和类风湿因子中的一种。在实施例2中公开FITC与自身免疫抗原连接，所用的连接缓冲液为0.1-0.2mol/LpH9.0-10.0的碳酸缓冲液。专利CN103149350A提供一种羧化纳米磁微粒与抗体的偶联方法，该专利采用2-吗啉乙磺酸作为偶联缓冲液，该缓冲液主要适用于抗体的偶联。对于结构特殊的增殖细胞核抗原，采用现有的这些偶联缓冲液如2-吗啉乙磺酸、碳酸缓冲液等存在抗原偶联效率低且不稳定的问题。有鉴于此，特提出本专利技术。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种增殖细胞核抗原的偶联方法，特定选用醋酸盐溶液进行偶联，解决了抗原偶联效率低、偶联重复性差的问题，使目标抗原能够稳定地偶联在磁微粒载体上，以便于应用于目标抗体的检测。为了实现本专利技术的上述目的，特采用以下技术方案：一种增殖细胞核抗原的偶联方法，包括以下步骤：活化的羧化微粒在醋酸盐溶液中与增殖细胞核抗原进行偶联反应。本专利技术提供的一种增殖细胞核抗原的偶联方法，是由专利技术人发现得到，选用醋酸盐溶液进行偶联，有效解决了抗原偶联效率低、偶联重复性差的问题，使目标抗原能够稳定地偶联在微粒载体上，便于应用于目标抗体的检测。本专利技术还针对增殖细胞核抗原的偶联条件进行了诸多方面的尝试(包括缓冲液种类、浓度、体积、pH等)，确立了增殖细胞核抗原偶联的最优条件，并且此缓冲液在其他蛋白的偶联过程中适用性极低，因此，醋酸盐缓冲液对增殖细胞核抗原与微粒如磁微粒的偶联有较强的专属性。具体实施方式本专利技术提供一种增殖细胞核抗原的偶联方法，包括以下步骤：活化的羧化微粒在醋酸盐溶液中与增殖细胞核抗原进行偶联反应。由于增殖细胞核抗原(PCNA)是真核生物复制复合体的核心成分，具有特殊的环状三级结构，结构较为复杂，现有的偶联缓冲液无法满足该抗原与磁微粒的偶联，也就是存在抗原偶联效率低、偶联重复性差的问题。基于此，本专利技术人发现，醋酸盐溶液作为偶联液能有效解决上述问题。本专利技术还针对增殖细胞核抗原的偶联条件进行了诸多方面的尝试(包括缓冲液种类、浓度、体积、pH等)，确立了增殖细胞核抗原偶联的最优条件，并且此缓冲液在其他蛋白的偶联过程中适用性极低，因此，醋酸盐缓冲液对增殖细胞核抗原与磁微粒的偶联有较强的专属性。具体如下：进一步地，所述醋酸盐溶液中的醋酸盐的浓度为10-100mM，pH为5±0.2，所述醋酸盐溶液中还含有氯化钠，所述氯化钠在所述醋酸盐溶液中的浓度为0-0.3M。偶联缓冲液浓度进行筛选，包括10mM、20mM、50mM、100mM，其中20mM、50mM合适。作为优选，所述醋酸盐溶液中的醋酸盐的浓度为20-50mM。对偶联缓冲液中的盐离子浓度进行筛选，包括0M、0.1M、0.15M、0.2M、0.3M，其中0.15M最优。作为优选，所述氯化钠在所述醋酸盐溶液中的浓度为0.1-0.2M。作为优选，所述醋酸盐溶液的组分为醋酸盐和醋酸。本专利技术中的醋酸盐为醋酸的金属离子盐，如可以为醋酸钠、醋酸钾等。优选地，所述醋酸盐为醋酸钠。本专利技术中，醋酸盐缓冲液由醋酸钠和醋酸配制得到。对偶联缓冲液体积进行筛选，包括50μL、100μL、200μL、400μL、800μL、1600μL，其中100μL最优。进一步地，所述偶联反应中，所述醋酸盐溶液的体积为50-200μL，优选为100-200μL。对抗原用量进行优化，包括包被10ng/人份、15ng/人份、20ng/人份、30ng/人份，其中20ng/人份最优。进一步地，所述增殖细胞核抗原的添加量为10-30ng，优选为20±5ng。对偶联反应时间进行筛选，包括偶联反应1h、1.5h、2h、2.5h、3h，其中2.5h最优。进一步地，所述偶联反应为：在室温条件下震荡1-3h，优选为1.5-2.5h。进一步地，所述震荡的条件为1000±200rpm。进一步地，偶联反应结束后经封闭处理，悬浮即可。进一步地，所述封闭处理采用的封闭液为牛血清白蛋白溶液，所述牛血清白蛋白溶液中的牛血清白蛋白的质量浓度为1％±0.2％。进一步地，所述封闭处理为先采用所述封闭液洗涤1-3次，然后加入所述封闭液，以1000±200rpm进行震荡处理50-80min。进一步地，所述悬浮采用含有质量浓度为1％±0.2％的牛血清白蛋白的PBST进行。进一步地，所述微粒为磁微粒、硅微粒、银微粒、金微粒或其复合微粒。复合微粒是指磁、硅、银、金中的任两种以上进行复合得到的微粒。进一步地，所述羧化微粒采用以下方法活化：微粒悬浮液中加入NHS溶液和EDC溶液处理。具体可以为，152μLMES缓冲液(pH6.0)重悬磁粒，加入28μL新鲜配制的NHS(50mg/mL)，涡旋混匀，再加入20μL新鲜配制的EDC(50mg/mL)，在室温下震荡50min(1000rpm/min)。去除上清后，磁微粒加入醋酸盐溶液悬浮，然后与增殖细胞核抗原进行偶联反应，等。下面将结合实施例对本专利技术的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本专利技术，而不应视为限制本专利技术的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。实施例1偶联缓冲液筛选：一、材料与仪器羧化磁微粒：表面含有羧基。增殖细胞核抗原：重组抗原，纯度大于90％。着丝粒蛋白B抗原：重组抗原，纯度大于90％。藻红蛋白标记的抗人IgG抗体：抗人IgG抗体来源于鼠。血清样本：由合作医院提供。2-吗啉乙磺酸(MES)、碳二亚胺、N-羟基琥珀酰亚胺、三羟甲基氨基甲烷、2-吗啉乙磺酸、4-羟乙基哌嗪乙磺酸、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、碳酸钠、碳酸氢钠、乙酸、醋酸钠、本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种增殖细胞核抗原的偶联方法，其特征在于，活化的羧化微粒在醋酸盐溶液中与增殖细胞核抗原进行偶联反应。

【技术特征摘要】
1.一种增殖细胞核抗原的偶联方法，其特征在于，活化的羧化微粒在醋酸盐溶液中与增殖细胞核抗原进行偶联反应。2.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述醋酸盐溶液中的醋酸盐的浓度为10-100mM，pH为5±0.2，所述醋酸盐溶液中还含有氯化钠，所述氯化钠在所述醋酸盐溶液中的浓度为0-0.3M；优选地，所述醋酸盐溶液中的醋酸盐的浓度为20-50mM；优选地，所述氯化钠在所述醋酸盐溶液中的浓度为0.1-0.2M；优选地，所述醋酸盐溶液的组分为醋酸盐和醋酸；优选地，所述醋酸盐为醋酸钠。3.根据权利要求2所述的偶联方法，其特征在于，所述偶联反应中，所述醋酸盐溶液的体积为50-200μL，优选为100-200μL。4.根据权利要求3所述的偶联方法，其特征在于，所述增殖细胞核抗原的添加量为10-30ng，优选为20±5ng。5.根据权利要求1所述的偶联方法，其特征在于，所述偶联反应为：在室温条件下...

【专利技术属性】
技术研发人员：曾敏霞，王国磊，陈敏华，储迅涛，邓京，
申请(专利权)人：珠海丽珠试剂股份有限公司，
类型：发明
国别省市：广东,44