一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用技术

本发明专利技术涉及一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用，本发明专利技术的有益效果为特异性强，敏感性高，简便快速，结果显示形象、直观、准确；节省费用，适用范围广，便于推广；制得的毒死蜱胶体金试纸条，无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟内即可判定结果，不仅操作简便、快速、结果直观准确、成本低，并且可以在室外进行检测。

【技术实现步骤摘要】
一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用
本专利技术涉及农产品检测领域，具体涉及一种毒死蜱单克隆抗体。
技术介绍
毒死蜱(Chlorpyrifos)又名氯吡硫磷，属于硫代磷酸酯类杀虫剂，通过抑制乙酰胆碱酯酶AChE或胆碱酯酶ChE的活性而破坏了正常的神经冲动传导，引起一系列中毒症状：异常兴奋、痉挛、麻痹、死亡。主要用于防治稻飞虱、稻纵卷叶螟、绵蚜、斜纹夜蛾、菜青虫、小菜蛾、蚜虫、根蛆等农业害虫。目前，对农药残留的检测方法主要是仪器分析方法，包括高效液相色谱法(Highperformanceliquidchromatography，HPLC)、气相色谱法(Gaschromatography，GC)、薄层色谱法(Thinlayerchromatography，TLC)、液-质串联法(HPLC-MS)和气-质串联法(GC-MS)等。这些方法结果可靠，灵敏度高，已有相关的技术标准可供参考。但由于需要昂贵的仪器、专门的操作人员，以及样品前处理复杂、成本高、时间长，因此不能更好地满足快速简便的现场检测要求。与仪器分析方法相比，免疫检测方法因其简便、经济、快速等优点而在农药残留检测领域中受到越来越多的关注。ELISA(EnzymeLinkedImmunosorbentAssay)方法是常用的免疫检测方法，但是其却有操作步骤相对较多，检测时间较长，检测结果不够直观，不能在线进行检测等缺陷。因而ELISA在毒死蜱的快速检测上的应用受到很大的限制。胶体金试纸条无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟即可判定结果，不仅操作简便、快速，且结果直观准确、成本低。但是，目前已报道的毒死蜱胶体金试纸条的灵敏度通常很难实现对复杂基质样品的快速检测。
技术实现思路
本专利技术目的是：提供一种毒死蜱单克隆抗体及其制备方法与应用。本专利技术的技术方案是：一种毒死蜱单克隆抗体，其抗体重链可变区氨基酸序列为：QVKLQQSGPGLVAPSQSLKTSICTVSGSLFPGLRGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWSGRTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQIDDSATYYCAQRREVRWGSVDMDYWGQGTSVTVSS；轻链可变区氨基酸序列为：DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDFSLTISSLEYEDLGIYYCLQYEEFPYTFGGGTKLEIKR。本专利技术还提供了一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：步骤(1)：毒死蜱半抗原的合成；步骤(2)：毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联；步骤(3)：抗毒死蜱单克隆抗体的制备；步骤(4)：抗体可变区氨基酸序列的测定。进一步的：所述步骤(2)中毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联的载体蛋白是利用活泼酯法将3,5,6-三氯-2-吡啶氧乙酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联的产物。进一步的：所述步骤(4)包括以下步骤：将步骤(3)中所制得的毒死蜱单克隆抗体免疫小鼠；无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合与培养，培养至细胞长满培养孔1/3～1/2时进行亚克隆，然后扩大培养，建立杂交瘤细胞株；使用特异性的细胞株制备腹水并用ProteinA进行抗体纯化，之后去盐并冷冻抽干获得干粉状抗体，冻存备用。进一步的：所述小鼠为6～8周龄健康的雌性BALB/c小鼠，毒死蜱单克隆抗体免疫健康的雌性BALB/c小鼠的每次间隔时间为2～3周，最后一次超强免疫后3天。进一步的：小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0以10：1的细胞数量用PEG介导的方法融合，融合后置于37℃、5％CO2培养箱中培养，所述亚克隆次数大于或等于3，且每次亚克隆均采用间接竞争ELISA法选择强阳性、抑制率高、细胞生长旺盛的孔进行亚克隆。进一步的：冻存的温度为-20℃。进一步的：所述毒死蜱半抗原的合成包括以下步骤：步骤a：O-乙基-O-(3，5，6三吡啶基)硫代磷酰氯的合成：将O-乙基硫代磷酰氯和K2CO3溶于乙腈中制得混合溶液，将3,5,6-三氯-2-羟基吡啶溶液于常温下逐滴加入所述混合溶液中，反应1h，获得反应液，将反应液真空过滤，蒸去溶剂，得到C1；对C1进行柱层析，用石油醚/二氯甲烷洗涤，蒸去溶剂得淡黄色油状液体；步骤b:O-乙基-O-(3，5，6三氯吡啶基)-N-(丁酸)硫代磷酸酯的合成:称取4-氨基丁酸与KOH溶解于甲醇中，冰水浴冷却至0-10℃，搅拌下缓慢加入溶解于甲醇溶液的O-乙基-O-(3，5，6三吡啶基)硫代磷酰氯，保温反应2h；反应完毕后，用石油醚/乙醚洗涤，水层调pH＝3.0后用乙醚提取，无水硫酸钠干燥，蒸去溶剂，得浅黄色油状物。进一步的：所述步骤a中石油醚/二氯甲烷的体积比为8:1，所述步骤b中石油醚/乙醚的体积比为7:1。本专利技术还提供了一种毒死蜱单克隆抗体的应用，包括以下步骤：1)毒死蜱金标抗体的制备；2)金标结合物垫的制备；3)毒死蜱半抗原偶联的载体蛋白溶液和兔抗鼠IgG抗体包被纤维素膜；4)毒死蜱胶体金试纸条。与现有技术相比，本专利技术的优点是：1)特异性强，敏感性高。本胶体金试纸条以胶体金标记高亲和力的单克隆抗体为基础制备而成，具有较强的特异性和较高的敏感性，检出最低限量可达到5ng/mL。2)简便、快速。在使用本胶体金试纸条时，无需任何其他辅助仪器，可现场操作，只要将检测样加入样品垫，在3至5分钟内即可判定检测结果。3)结果显示形象、直观、准确。胶体金试纸条的检测结果以纤维素膜上的显色情况来判断。如果样品中有待测物时，待测物和金标抗体结合形成抗原－金标抗体复合物，并且继续上移，遇隐形检测线T线不显色或者显色很弱即表示检测样品阳性或者弱阳性；如果样品中没有待测样品时，金标抗体继续上移，遇隐形检测线T线显示一条清晰红线即表示检测样品阴性。隐形对照线C线颜色的有或无表示此试纸条的有效或无效。结果判定形象、直观、准确、简单明了。4)节省费用，适用范围广，便于推广。使用胶体金试纸条进行检测，比使用仪器和ELISA试剂盒检测进行检测的费用大幅降低。再者，试纸条的使用范围广，可满足不同层次人员的需要，便于推广应用，具有广阔的市场前景和明显的经济和社会效益。本专利技术的毒死蜱胶体金试纸条，无需专业操作人员及任何辅助类仪器，根据反应所显现的条带几分钟内即可判定结果，不仅操作简便、快速、结果直观准确、成本低，并且可以在室外进行检测。附图说明下面结合附图及实施例对本专利技术作进一步描述：图1为毒死蜱胶体金检测试纸条俯瞰结构示意图；图2为毒死蜱胶体金测试纸条剖面结构示意图；图3为毒死蜱胶体金检测试纸条结果判定示意图；其中：1：衬板；2：样品垫；3：金标结合物垫；4：纤维素膜；5：检测线；6：对照线；7：吸水垫；8-1：样品浸入端保护膜；8-2：手柄端保护膜；9：标识线；A、阴性样品检测结果；B、弱阳性样品检测结果；C、强阳性样品检测结果；D、试纸条失效结果；E、试纸条失效结果。具体实施方式实施例：一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：1、毒死蜱半抗原的合成合成O-乙基-O-(3，5，6三吡啶基)硫代磷酰氯。称取3,5,6-三氯-2-羟基吡啶4.26g，溶于乙腈。常温下，将溶液逐滴加入20mL乙腈本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种毒死蜱单克隆抗体，其特征在于：其抗体重链可变区氨基酸序列为：QVKLQQSGPGLVAPSQSLKTSICTVSGSLFPGLRGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWSGRTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQIDDSATYYCAQRREVRWGSVDMDYWGQGTSVTVSS；轻链可变区氨基酸序列为：DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDFSLTISSLEYEDLGIYYCLQYEEFPYTFGGGTKLEIKR。

【技术特征摘要】
1.一种毒死蜱单克隆抗体，其特征在于：其抗体重链可变区氨基酸序列为：QVKLQQSGPGLVAPSQSLKTSICTVSGSLFPGLRGVSWVRQPPGKGLEWLGVIWSGRTNYHSALISRLSISKDNSKSQVFLKLNSLQIDDSATYYCAQRREVRWGSVDMDYWGQGTSVTVSS；轻链可变区氨基酸序列为：DIKMTQSPSSMYASLGERVTITCKASQDINRYLSWFQQKPGKSPKTLIYRANRLVDGVPSRFSGSGSGQDFSLTISSLEYEDLGIYYCLQYEEFPYTFGGGTKLEIKR。2.一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：步骤(1)：毒死蜱半抗原的合成；步骤(2)：毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联；步骤(3)：抗毒死蜱单克隆抗体的制备；步骤(4)：抗体可变区氨基酸序列的测定。3.根据权利要求2所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)中毒死蜱半抗原与载体蛋白偶联的载体蛋白是利用活泼酯法将3,5,6-三氯-2-吡啶氧乙酸与牛血清白蛋白(BSA)偶联的产物。4.根据权利要求2所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)包括以下步骤：将步骤(3)中所制得的毒死蜱单克隆抗体免疫小鼠；无菌条件下取出小鼠脾细胞，将小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2/0融合与培养，培养至细胞长满培养孔1/3～1/2时进行亚克隆，然后扩大培养，建立杂交瘤细胞株；使用特异性的细胞株制备腹水并用ProteinA进行抗体纯化，之后去盐并冷冻抽干获得干粉状抗体，冻存备用。5.根据权利要求4所述的一种毒死蜱单克隆抗体的制备方法，其特征在于：所述小鼠为6～8周龄健康的雌性BALB/c小鼠，毒死蜱单克隆抗体免疫健康的雌性BALB/c小鼠的每次间隔...

【专利技术属性】
技术研发人员：盛相国，
申请(专利权)人：苏州快捷康生物技术有限公司，
类型：发明
国别省市：江苏,32