检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜及方法技术

本发明专利技术涉及检测青海血蜱体内有无牛羊梨形虫，并可区分是何种梨形虫的检测膜。本发明专利技术用于检测牛羊体内吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和梨形虫的检测膜是在Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ｃ薄膜上固定有吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，或者其上还固定有巴贝斯虫特异性寡核苷酸和泰勒虫通用特异性寡核苷酸。本发明专利技术的检测方法是待检血蜱体内提取的ＤＮＡ作为模板，以特定的引物进行ＰＣＲ扩增，其产物与检测的泰勒虫和巴贝斯虫的寡核苷酸进行杂交，再经增强化学发光孵育后将杂交后的膜放置曝光储片夹内，在薄膜上放Ｘ光胶片进行曝光、显影等处理，根据胶片上产生的强度信号确定被检动物是否有患有相应的疾病。

【技术实现步骤摘要】

本专利技术涉及一种检测青海血蜱体内是否带有牛羊梨形虫，并可区分出患病 动物寄生有何种梨形虫的检测膜、这种检测膜的制备方法和使用方法。技术背景梨形虫病是由顶复门、梨形虫纲中、梨形虫目的巴贝斯科和泰勒科的原虫 引起的血液原虫病的总称。梨形虫病又名"焦虫病"或"血孢子虫病"。是由 媒介蜱传播的巴贝斯科的巴贝斯属和泰勒科的泰勒属的多种梨形虫寄生于红细 胞内所引起的血液原虫病，临床以高热、贫血、黄疸和血红蛋白尿为主要特征， 严重时可造成死亡。由于全世界各地分布有各种各样的蜱类，所以该病的分布也很广，1914年最先发现于埃及，随后在非洲、欧洲、亚洲的许多国家都发现 该病原。比如原苏联、印度、斯里兰卡、日本，南美洲，非洲，亚洲，以及 南欧等地都有此病发生的报道。我国的养牛、羊区主要分布于北部地区。相关 调查表明，在这些地区梨形虫病甚为流行。青海血蜱隶属于硬蜱科，是邓国藩 1978年命名的一个新种。它分布于我国的青海，甘肃，宁夏，四川，云南等海 拔高度在1600-4200米的区域，国外尚无记录，该蜱生活与山区草地或灌木丛， 属三宿主蜱，在自然界3年完成1个世代，近年来的研究表明，青海血蜱是羊泰 勒虫，包括尤氏泰勒虫和吕氏泰勒虫，中华泰勒虫和羊莫氏巴贝斯虫四种梨形 虫病的传播媒介。现有技术中对梨形虫病的诊断方法主要包括三种方法(l)通过血涂片的方 法和临床症状，参见Leemans I, Hooshmand-Rad P， Uggla A. The indirect fluorescent antibody test based on schizont antigen for study of the sheep parasite T72ez7en.a ksfc^waraf/. Veterinary Parasitology, 1997， 69(1-2): 9 18. 。 (2)应用一 些血清学方法，如:补体结合试验(CFT)和间接荧光抗体试验(IFAT)检测，但 这些方法很难排除不同种之间的交叉反应，而且常会出现假阳性和漏检，参见 Bruning A. Equine piroplasmosis an update on diagnosis. Br Vet J, 1996， 152: 139 151禾口Papadopoulos B， Brossard M, Perie NM (1996) Piroplasms of domestic animals in the Macedonia region of Greece. Piroplasms of small ruminants. Vet Parasitol 63:67-74.。 (3) PCR技术，是目前检测泰勒虫最常用的分子诊断方法， 与常规的方法相比具有敏感性高、特异性强、检出率高等优点。但PCR方法通常 不能同时检测出混合感染的发生，参见Alhassan A, Pumidonming W, OkamuraM, Hirita H， Battsetseg B， Fujisaki F， Yokoyama N, Igarashi I (2005) Development of asingle-round and multiplex PCR method for the simultaneous detection of Babesia caballi and Babesia equi in horse blood. Vet Parasitol 129:43~49,。提供一种能同时检测出被检牛羊是否患有梨形虫病，特别是能检测出混合 感染，并区分出患病动物所患为何种梨形虫病，对牛羊的饲养、疾病防治有着 积极的意义。
技术实现思路
本专利技术提供一种能同时检测出被检牛羊是否患有梨形虫病，特别是能检测 出混合感染，并可以区分出患病动物所患为何种梨形虫病的检测膜，以及这种 检测膜的制备方法和使用方法。本专利技术用于检测牛羊体内吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和梨形虫的检测膜是在 Biodyne C薄膜上固定有吕氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，或者其上 还固定有巴贝斯虫特异性寡核苷酸和泰勒虫通用特异性寡核苷酸。本专利技术用于检测牛羊体内吕氏泰勒虫、尤氏泰勒虫和梨形虫的检测膜中， 在Biodyne C薄膜上固定的吕氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为 atcttctttttgatgagttg,固定的尤氏泰勒虫特异性寡核苷酸序列为tgcattttccgagtgttact， 固定的梨形虫通用寡核苷酸序列为ctgtcagaggtgaaattct，固定的巴贝斯虫通用寡 核苷酸序列为ccttggtaatggttaataggaa，固定的中华泰勒虫特异性寡核苷酸探针序 列为tcgcatetcttgctgagtg ，固定的莫氏巴贝斯虫特异性寡核苷酸序列为 gaatgatgccgacttaaaccct 。本专利技术用于检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜的制备方法是分别人工 合成出梨形虫通用寡核苷酸探针，泰勒虫通用寡核苷酸探针，巴贝斯虫通用寡 核苷酸探针，中华泰勒虫特异性寡核苷酸，莫氏巴贝斯虫特异性寡核苷酸，吕 氏泰勒虫和尤氏泰勒虫的特异性寡核苷酸，将所得到的各寡核苷酸5'端用氨基 团修饰，再将其分别共价结合到带有负电荷的Biodyne C薄膜上。采用本专利技术的检测膜检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的方法是以从待检青海 血蜱体内提取的DNA作为模板，在泰勒虫和巴贝斯虫18S rRNA基因序列V4 高变区两端的保守区域设计一对扩增出的片段大小为480bp-491bp的引物，其中 一条引物用生物素标记，然后进行PCR扩增，获得生物素标记的PCR产物，生 物素标记的PCR产物和固定在Biodyne C膜上的泰勒虫和巴贝斯虫的寡核苷酸 进行杂交，再经增强化学发光孵育后将杂交后的膜放置曝光储片夹内，在薄膜 上放X光胶片进行曝光，再对胶片进行显影和定影处理，根据胶片上产生的强 度信号确定被检动物是否有患有相应的疾病。综上所述，本专利技术根据己报道的梨形虫18SrRNA基因序列设计梨形虫的通用性引物对和梨形虫种特异性寡核苷酸探针固定于Biodyne C薄膜上，将PCR 方法和RLB方法相结合建立了一种特异，敏感的诊断方法，可以识别相应的梨 形虫种或属；其敏感性明显高于槽式PCR方法。 本专利技术有如下优点采用本专利技术的检测膜可以很方便地检测出被检青海血蜱体内是否带有梨形 虫，并可区分出青海血蜱体内所带的为何种梨形虫，例如携带的是中华泰勒虫， 莫氏巴贝斯虫还是吕氏泰勒虫或尤氏泰勒虫。由于本专利技术的检测膜上还固定有 梨形虫的通用寡核苷酸探针，因此本专利技术可以同时检测多个虫种的存在，这对 于牛羊群疾病的控制及预防治疗有积极的意义。本专利技术的方法最大优点是可以同时检测出青海血蜱体内同时携带有泰勒 虫和巴贝斯虫的情况，而且只需要作一次PCR，如果有扩增产物，说明该蜱肯定 是携带有巴贝斯虫或泰勒虫的某一种或几个种。另外，PCR产物与探针杂交后， 还能说明被检蜱所携带的虫体的种类，这对于疾病的控制及预防有更为积极的 意义。第三，本专利技术的敏感性要高于PCR，且能同时区分病原的属和种，这一特 性在流行病学调查上具有重要意义。由于与探针杂交的PCR产物可以除去，因此 杂交膜可以反本文档来自技高网...

【技术保护点】
一种用于检测青海血蜱体内牛羊梨形虫的检测膜，其特征是在Ｂｉｏｄｙｎｅ　Ｃ薄膜上固定有牛羊梨形虫的特异性寡核苷酸探针。

【技术特征摘要】

【专利技术属性】
技术研发人员：殷宏，罗建勋，牛庆丽，关贵全，马米玲，刘爱红，刘志杰，高金亮，党志胜，李有全，任巧云，刘军龙，
申请(专利权)人：中国农业科学院兰州兽医研究所，
类型：发明
国别省市：62[中国|甘肃]