一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒制造技术

本发明专利技术公开了一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒，包括犬CRP单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的犬CRP单克隆抗体、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物和清洗液。本发明专利技术具有快速检测、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、稳定性好、试剂用量小、成本低、操作简便，对使用人员要求低的优点。

【技术实现步骤摘要】
一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒
本专利技术属于免疫分析
，尤其涉及一种犬CRP的检测试剂盒。
技术介绍
机体在受到细菌感染或组织损伤等刺激时，会出现急性期反应，受到刺激的细胞会释放促炎因子，促进肝脏合成一些急性期反应蛋白，并从肝细胞中分泌至血液。C反应蛋白(C-neactveprotein,简称CRP)是犬最主要的，也是很敏感的急性时相反应蛋白。在钙离子存在时CRP与肺炎球菌C-多糖起沉淀反应形成复合物，在动物遭受细菌感染或者组织伤时，血清中一些急剧上升的蛋白质（如急性蛋白CRP），激活补体和加强吞噬细胞的吞噬而起调理作用，清除入侵机体的病原微生物和损伤，坏死，凋亡的组织细胞。CRP在机体的免疫反应方面有着积极作用，在很多病症中会出现显著变化。CRP在炎症发生后数小时就开始升高，48小时可以到达顶峰，在疾病恢复期迅速下降。CRP升高的程度反应炎症的大小或活动性，在急性炎症和感染时CRP与疾病活动性有良好的相关性，CRP值可为快速决定提供一种方法。因此，CRP可以作为急性感染和炎症性疾病的一种标志，在疾病早期检测犬CRP值对犬做出正确的诊断及其重要。常用的CRP检测方法多种多样，主要有乳胶免疫比浊法、放射免疫测定、ELISA法及化学发光法等。乳胶免疫比浊法是利用抗原抗体反应形成免疫复合物，产生的浊度与CRP含量呈正比，用比浊法进行测定，从而求得CRP的含量，此方法灵敏度和线性无法兼顾。ELISA法稳定性好，但操作步骤繁琐、反应时间长且检测灵敏度较低。放射免疫测定灵敏度高，但弊端较大，如会存在放射性同位素损伤、污染及不稳定等，且容易对操作人员造成伤害。目前测试人CRP含量的试剂盒已相对较为成熟和稳定，但测试犬CRP含量的ELISA试剂盒，操作步骤繁琐、反应时间长、检测灵敏度较低且试剂使用量大，对使用人员要求高。面对日益庞大的宠物市场，简便、迅速、准确检测犬CRP含量的会成为主流方向。
技术实现思路
为解决上述现有技术的不足，本专利技术提供了一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒，该试剂盒具有快速检测、灵敏度高、特异性强、线性范围宽、稳定性好、试剂用量小、成本低、操作简便，对使用人员要求低的优点。为了达到上述技术目的，本专利技术所采用的技术方案是：一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：包括犬CRP单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的犬CRP单克隆抗体、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物和清洗液。所述毛细管为高精度毛细管，其外径为1.2±0.02mm，内径为0.7±0.005m，长度为30±1mm，材质为高硼硅3.3玻璃。所述犬CRP单克隆抗体包被的毛细管是通过采用犬CRP单克隆抗体EDC一步法包被毛细管或者采用犬CRP单克隆抗体SMCC包被毛细管的方法来制备的。所述犬CRP单克隆抗体EDC一步法包被毛细管具体步骤如下：制取包被液：在50M的MES缓冲液中加入EDC和犬CRP单克隆抗体混匀后，得到包被液Ⅰ；包被液Ⅰ中，EDC的浓度为5～400ug/mL，犬CRP单克隆抗体的浓度为2～10ug/mL；包被：将表面氨基化的毛细管浸泡在包被液Ⅰ中进行包被，包被温度为室温，包被时间为20～40min；清洗：将包被后的毛细管用pH=7.4的50mM的Tris～HCl溶液淋洗并吹干。所述MES缓冲液包括如下成分：MES0.05～1.5MNaCl0.05～1.5MMgCl21～5mMZnCl20.01～0.1mMBSA0.2～1.5%（质量百分比）吐温200.2～0.6%（体积百分比）。所述犬CRP单克隆抗体SMCC包被毛细管具体步骤如下：活化犬CRP单克隆抗体：将犬CRP单克隆抗体浓缩至3mg/mL～5mg/mL，并用2-IT活化犬CRP单克隆抗体；活化毛细管：将表面氨基化的毛细管浸泡在SMCC中进行活化处理，浸泡时间为1.5h，浸泡温度为室温，活化完成后，用pH=7.4的50mM的Tris～HCl溶液淋洗并吹干，所述SMCC的浓度为2mg/mL；包被：将活化后的犬CRP单克隆抗体用pH=7.4的TSE溶液稀释至10ug/mL，制成包被液Ⅱ，将活化后的毛细管浸泡在包被液Ⅱ中进行包被，包被时间为12～24h，包被温度为4℃；所述TSE溶液包括如下成分：三乙醇胺0.05~0.2M氯化钠0.05~0.2MEDTA.2Na.2H2O0.5~1.5mM氯化镁0.5~1.5mM氯化锌0.05~0.13mM。清洗：将包被后的毛细管用pH=7.4的50mM的Tris～HCl溶液淋洗并吹干；封闭：用50mM的Tris～HCl溶液浸泡封闭包被后的毛细管，封闭温度为37℃，封闭时间为3h，封闭完成后用清洗液淋洗并吹干，所述Tris～HCl溶液中含有2%（质量百分比）的BSA和0.1M的甘氨酸。所述碱性磷酸酶标记的犬CRP单克隆抗体通过如下方法制成：犬CRP单克隆抗体活化：将犬CRP单克隆抗体浓缩至3mg/mL～5mg/mL，并用2-IT进行活化处理；碱性磷酸酶活化：将碱性磷酸酶浓缩至2mg/mL～4mg/mL，并用SMCC进行活化处理；混合：将活化后的碱性磷酸酶和犬CRP单克隆抗体的按照摩尔比例为1.2:1混合，并加入1/500犬CRP单克隆抗体体积的1M的MgCl2溶液，在温度为4℃的条件下，反应12～24h后，加入终止剂终止反应，终止反应后，进行纯化处理，得到碱性磷酸酶标记的犬CRP单克隆抗体。所述碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物为AMPPD或APS-5。所述清洗液通过如下方法配置：在pH=7.4的50mM的Tris～HCl溶液中加入氯化钠、CHAPS和曲拉通，溶解后即可得到清洗液，清洗液中，氯化钠的质量百分浓度为0.9%，CHAPS的质量百分浓度为0.1%，曲拉通的质量百分浓度为0.1%。本专利技术还提供了CRP系列校准品，所述犬CRP系列校准品通过如下方法配置：用pH=7.4的50mM的Tris～HCl缓冲液将犬CRP纯品稀释成六个水平的冻干校准品，用纯水复溶后，CRP校准品的浓度分别为6.25ug/mL、12.5ug/mL、25ug/mL、50ug/mL、100ug/mL和200ug/mL。本专利技术的试剂盒还包括毛细管化学发光检检测装置，该毛细管化学发光检测装置采用授权公告号为CN107091923B，授权公告日为2018年1月30日的中国专利技术专利公开的毛细管化学发光检测装置。将碱性磷酸酶标记的犬CRP单克隆抗体、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物和清洗液装在其液体试剂杯里，而将犬CRP单克隆抗体包被的毛细管替换下该专利中的毛细管本体即可。本专利技术相对于现有技术具有如下有益效果：本专利技术研制的CRP检测试剂盒采用的是双抗体夹心两步法反应模式，以毛细管为载体，用化学发光免疫方法检测犬CRP抗原含量。采用毛细管为载体，毛细管容积小，极大地降低了原料用量，节约成本；检测使用样本量只需10～15uL，极大地降低了样本使用量，在一定程度上解决了小型犬样本量少的问题。本专利技术犬CRP检测试剂盒采用单克隆抗体，单克隆抗体特异性强、纯度高、无污染性且非特异性结合概率小，可大批量的生产。同时本专利技术的试剂盒检测范围为0～200ug/mL，样本检测过程快速、操作简便、结果准确度高、灵敏度高，且本专利技术的试剂保存时间长、无放射性污染、试剂使用量小，使本文档来自技高网...

【技术保护点】
1.一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：包括犬CRP单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的犬CRP单克隆抗体、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物和清洗液。

【技术特征摘要】
1.一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：包括犬CRP单克隆抗体包被的毛细管、碱性磷酸酶标记的犬CRP单克隆抗体、碱性磷酸酶催化发光的化学发光底物和清洗液。2.根据权利要求1所述的一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述犬CRP单克隆抗体包被的毛细管是通过采用犬CRP单克隆抗体EDC一步法包被毛细管或者采用犬CRP单克隆抗体SMCC包被毛细管的方法来制备的。3.根据权利要求2所述的一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述犬CRP单克隆抗体EDC一步法包被毛细管具体步骤如下：制取包被液：在MES缓冲液中加入EDC和犬CRP单克隆抗体混匀后，得到包被液Ⅰ；包被液Ⅰ中，EDC的浓度为5～400ug/mL，犬CRP单克隆抗体的浓度为2～10ug/mL；包被：将表面氨基化的毛细管浸泡在包被液Ⅰ中进行包被，包被温度为室温，包被时间为20～40min。4.根据权利要求2所述的一种犬CRP的化学发光免疫检测试剂盒，其特征在于：所述犬CRP单克隆抗体SMCC包被毛细管具体步骤如下：活化犬CRP单克隆抗体：将犬CRP单克隆抗体浓缩至3mg/mL～5mg/mL，并用2-IT活化犬CRP单克隆抗体；活化毛细管：将表面氨基化的毛细管浸泡在SMCC中进行活化处理，浸泡时间为1.5h，浸泡温度为室温；包被：将活化后的犬CRP单克隆抗体用pH=7.4的TSE溶液稀释至10ug/mL，制成包被液Ⅱ，将活化后的毛细管浸泡在包被液Ⅱ中进行包被，包被时间为12～24h，包被温度为4℃；封闭：用Tris～HCl溶液浸泡封闭包被后的毛细管，封闭温度为37℃，封闭时间为3h，封闭...

【专利技术属性】
技术研发人员：阙婷，冉鹏，
申请(专利权)人：成都普利泰生物科技有限公司，
类型：发明
国别省市：四川,51