本发明专利技术公开了一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用。该试剂盒包括酶标板、阳性对照血清、阴性对照血清、酶标猪伪狂犬病毒单克隆抗体、样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液，其中所述酶标板包被有利用杆状病毒表达系统及细胞悬浮培养工艺表达的猪伪狂犬病毒gE蛋白，将其纯化后作为包被抗原，同时用作免疫原，制备并筛选出伪狂犬病毒gE蛋白的特异性单克隆抗体并进行过氧化物酶标记作为阻断酶标单抗。本发明专利技术试剂盒敏感性高、特异性好、且操作便捷，结果判定采用S/N比值法，准确度高，与进口试剂盒相比，检测符合率达98％以上。
【技术实现步骤摘要】
一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用
本专利技术属于生物检测
，更具体地，本专利技术涉及一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒及其应用，适用于种猪伪狂犬病毒gE抗体的特异、快速、准确检测。
技术介绍
伪狂犬病(Pseudorabies)，又名奥耶斯基病(Aujeszky’sdisease，AD)，是由伪狂犬病病毒(Pseudorabiesvirus，PRV)引起的一种急性传染病。该病能够侵害包括猪、牛、绵羊、兔、狐狸、犬猫、雪貂、鼠、水貂等多种动物。猪是天然宿主和储存者，除了猪，其余动物发病后均出现瘙痒、高热和脑脊髓炎症状，甚至可导致死亡。猪感染PRV后主要引起妊娠母猪流产、死胎、木乃伊胎与种猪不育，哺乳仔猪出现神经症状后死亡率高，育成育肥猪呼吸道症状，PRV病毒感染易形成潜伏感染，导致长期带毒、向外界排毒；另外，PRV在应激条件下易被激活，可引起反复感染和散毒，因而该病的净化和根除对整个养猪业非常重要。PRV病毒颗粒呈150～180nm的椭圆形或球状病毒颗粒，是典型的疱疹病毒结构，其由核蛋白核心、拥有162个壳粒的二十面体核衣壳、蛋白壳皮与脂质双层膜四部分组成。gE是非PRV复制必须的囊膜蛋白，含有577个氨基酸残基，是一种异二聚体的膜蛋白，在α疱疹病毒中高度保守，介导PRV与受感染动物细胞之间的融合，促使PRV扩散与PRV的释放，促进嗜神经向性。在我国，预防、控制和根除伪狂犬病是当前面临的一项艰巨的任务，目前市场上使用的猪伪狂犬疫苗绝大多数是缺失gE基因与TK基因的弱毒疫苗。疫苗免疫后，动物体内检测不到针对gE的抗体，而感染野毒株后，由于野毒株含有gE基因，因此感染野毒株的动物体内能够检测到gE抗体，从而可以通过检测血清样品中是否存在gE抗体来判断动物是否感染野毒。目前，酶联免疫吸附试验(Enzyme-LinkedImmunosorbentAssays,ELISA)是市场上主流的免疫测定技术，已广泛应用于临床检测，快速便捷且灵敏度高，且不需要特殊的仪器设备，可用于猪伪狂犬病毒的抗体检测。目前市场上，用于检测猪伪狂犬病毒抗体的试剂盒多为间接ELISA抗体检测试剂盒，该方法的敏感性和特异性在检测猪伪狂犬病毒抗体水平上有一定的局限性，对于包被抗原纯度的要求比较高，否则容易出现假阳性和假阴性。本专利技术是基于针对猪伪狂犬病毒gE的特异性单克隆抗体的阻断ELISA抗体检测方法，使得该试剂盒具有很好的敏感性和特异性。
技术实现思路
本专利技术的目的在于提供一种敏感性高、特异性强、能够快速、简便地检测猪伪狂犬病毒gE抗体的阻断ELISA试剂盒。该试剂盒的优点之一是使用了辣根过氧化物酶(HRP)标记的单克隆抗体，提高了检测的敏感性和特异性。基于上述目的，本专利技术的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括以猪伪狂犬病毒gE蛋白为包被抗原的的酶联反应板和酶标抗体；所述酶标抗体为与猪伪狂犬病毒gE蛋白特异性结合的单克隆抗体(PRV-Mc2)制成的酶标抗体。所述酶标抗体优选为经辣根化物酶标记抗体，所述辣根过氧化物酶可通过戊二醛法或过碘酸法交联在抗体上。优选的，所述猪伪狂犬病毒gE蛋白为利用杆状病毒表达系统以及昆虫细胞悬浮培养工艺表达获得猪伪狂犬病毒gE纯化蛋白。猪伪狂犬病毒gE纯化蛋白的序列为序列表中序列6。优选的，所述猪伪狂犬病毒gE蛋白特异性结合的单克隆抗体(PRV-Mc2)含有重链可变区PRV-Mc2-VH和轻链可变区PRV-Mc2-VL；所述PRV-Mc2-VH和PRV-Mc2-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc2-VH和所述PRV-Mc2-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc2-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第25～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第52～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第94～108位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第24～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第50～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第94～100位氨基酸所示。优选的，所述PRV-Mc2-VH的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1的第1～123位所示；其PRV-Mc2-VL的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2的第1～117位所示。所述酶联反应板的最佳包被制备方法及条件是将所述猪伪狂犬病毒gE纯化蛋白溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔0.1μg～1μggE纯化蛋白，2～8℃下放置8～12小时，使包被抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。优选的，所述试剂盒还包括阳性对照血清和阴性对照血清，所述阳性对照血清为所述猪伪狂犬病毒人工感染后采集的猪血清；所述阴性对照血清为无特定病原体(无猪伪狂犬病毒病原体感染且无疫苗接种)的猪血清。更进一步的，所述试剂盒还包括样品稀释液、20倍浓缩洗涤液、底物液A、底物液B、终止液。所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板。所述样品稀释液为含有5mg/ml酪蛋白的0.01M、pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述20倍浓缩洗涤液为含有浓度为0.8％～1.2％(ml/ml)的Tween-20的0.01M，pH值为7.4的磷酸盐缓冲液。所述底物液A为含0.6mg/ml过氧化氢尿素的柠檬酸磷酸盐缓冲液，所述底物液B为0.2mg/ml的四甲基联苯胺溶液，使用时两者以1:1的比例混合。所述终止液为2mol/L的硫酸溶液。本专利技术还要求保护单克隆抗体，其可与猪伪狂犬病毒特异性结合，是下述任意一项所述的单克隆抗体：1)含有重链可变区PRV-Mc2-VH和轻链可变区PRV-Mc2-VL；所述PRV-Mc2-VH和PRV-Mc2-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc2-VH和所述PRV-Mc2-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc2-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第25～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第52～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第94～108位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第24～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第50～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第94～100位氨基酸所示。2)所述PRV-Mc2-VH的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1的第1～123位所示；其PRV-Mc2-VL的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2的第1～117位所示。通本文档来自技高网...
【技术保护点】
1.一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板和酶标抗体，其中所述酶联反应板包被有猪伪狂犬病毒gE蛋白，酶标二抗为用辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白的单克隆抗体。
【技术特征摘要】
1.一种猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，包括酶联反应板和酶标抗体，其中所述酶联反应板包被有猪伪狂犬病毒gE蛋白，酶标二抗为用辣根过氧化物酶标记的抗猪伪狂犬病毒gE蛋白的单克隆抗体。2.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板为可拆卸96孔酶标板；所述猪伪狂犬病毒gE蛋白为利用杆状病毒表达系统以及昆虫细胞悬浮培养工艺表达获得；所述猪伪狂犬病毒gE蛋白的序列为序列表中序列6。3.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述抗猪伪狂犬病毒gE蛋白的单克隆抗体，含有重链可变区(PRV-Mc2-VH)和轻链可变区(PRV-Mc2-VL)；所述PRV-Mc2-VH和PRV-Mc2-VL均由决定簇互补区和框架区组成；所述PRV-Mc2-VH和所述PRV-Mc2-VL的决定簇互补区均由CDR1、CDR2和CDR3组成；所述PRV-Mc2-VH的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第25～34位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第52～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VH的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.1的第94～108位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR1的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第24～35位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR2的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第50～59位氨基酸所示；所述PRV-Mc2-VL的CDR3的氨基酸序列如SEQIDNo.2的第94～100位氨基酸所示。4.根据权利要求3所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述PRV-Mc2-VH的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.1的第1～123位所示；其PRV-Mc2-VL的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo.2的第1～117位所示。5.根据权利要求1-4中任意一项所述的猪伪狂犬病毒gE阻断ELISA抗体检测试剂盒，其特征在于：所述酶联反应板的获得方法是将所述猪伪狂犬病毒gE蛋白溶于100μl的pH9.6的碳酸盐溶液，然后加到96孔聚苯乙烯酶联反应板，每孔0.1μg～1μg猪伪狂犬病毒gE蛋白，2～8℃下放置8～12小时，使包被抗原与酶联反应板充分结合，然后按照300μl/孔加入含有10mg/ml牛血清白蛋白pH7.4的PBS缓冲液，37℃封闭处理2～3小时，甩干后，待酶联反应板干燥后4℃密封保存。6.根据权利要求1所述的猪伪狂犬病毒...
【专利技术属性】
技术研发人员：董春娜，张蕾，李静，李玲，王飞，肖进，齐鹏，
申请(专利权)人：中牧实业股份有限公司，
类型：发明
国别省市：北京,11
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